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实验24 醋酸纤维薄膜电泳法分离动物血清蛋白质

一、目的

掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理、操作及测定动物血清中各种蛋白质的相对百分含量技术。

二、原理 （不同蛋白质的等电点不同）

蛋白质是两性电解质。在pH小于其等电点的溶液中成为带正电荷的阳离子，在电场中移向阴极；在pH大于其等电点的溶液中则成为带负电荷的阴离子，在电场中可移向阳极。动物血清中含有数种蛋白质，在同一pH条件下，由于其解离状况不同，各种蛋白质所带电荷也不同，因此，在电场中移动速度不同，采用电泳法可将其分离。采用醋酸纤维膜为支持物的电泳法称为醋酸纤维薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素乙酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂沫成均匀的薄膜。待溶剂蒸干后，则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有一定的泡沫状结构，渗透性强，其厚度约为120μm。

醋酸纤维薄膜电泳具有操作简单、微量、快速、分辨率高、对样品无拖尾和吸附等优点。目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白、同工酶的分离和测定等方面。

动物血清蛋白：1、血清蛋白

球蛋白：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白

β-球蛋白、r-球蛋白

三、仪器、试剂和材料

（1）仪器：①中压电泳仪（带电泳槽）；②培养皿；③盖某某；载玻片；④醋酸纤维薄膜；⑤试管；⑥分光光度计；⑦滤纸。

（2）试剂：① 0.0 7 mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH 8.5，离子强度0.06 mol／L)（ 称取巴比妥1.66 g和巴比妥钠12.76 g，溶于少量水中，并定容至1 000 mL）；②染色液（称取氨基黑10B 0.5 g加水40 mL、甲醇50 mL和冰乙酸10 mL、混匀，装具塞试剂瓶中储存）；③漂洗液（95 ％乙醇45 mL、冰乙酸5 mL和水50 mL，混匀，装具塞试剂瓶中储存）；④透明液甲液（冰乙酸15 mL、无水乙醇85 mL，混匀，装具塞试剂瓶中贮存）、乙液（冰乙酸25 mL、无水乙醇75 mL，混匀，装具塞试剂瓶中储存）；⑤0.4mol/L氢氧化钠溶液；⑥液体石蜡。

（3）材料：新鲜动物血清。

四、操作步骤

1.仪器和薄膜的准备

（1）醋酸纤维薄膜的润湿和选择 将薄膜置于装有缓冲液的培养皿中，使它漂浮在液面。若迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀。否则表明薄膜的厚度不匀。实验中应选择前者，而不能选用后者。后者对实验结果影响颇大，会造成区带歪扭不齐，各带界限不清，背景脱色困难，结果难于重复等问题。

将选用的薄膜用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液中，约0.5 h后取出，用清洁的滤纸吸

去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面。

(2)制作电桥 将缓冲液倒入电泳槽，根据电泳槽纵向尺寸，于两极支架上各放入三层滤纸，滤纸一端与支架前沿对齐；另一端浸入缓冲液中，除去气泡使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。它的作用是联系薄膜和缓冲液之间的“桥梁”。

(3)平衡 用平衡装置(或自制的平衡管)使两槽内缓冲液的液面处于水平状态，需平衡15～20 min。

2.点样

将薄膜的无光泽面朝上，在距负极端1.5 cm处，用毛细管或盖某某取0.1 mL血清均匀“印”在薄膜的点样点处。点样时应使血清均匀地分布在点样区，形成有一定的宽度，粗细匀称的直线，这是获得清晰区带电泳图谱的重要环节之一。可事先在滤纸上练习，掌握点样技术。

3.电泳

将点好样的薄膜，无光泽面向下，两端贴在电泳槽支架的滤纸上，(点样端放负极)，平衡10 min，打开电泳仪开关，调节电流，调到每厘米宽薄膜电流强度为0.3 mA。电泳10～15 min，将电流提高到每厘米宽0.4～0.6 mA，电压为每厘米长10V左右。电泳45～50 min(电泳区带展开3.5 cm左右)关闭电源。电泳过程中防止电流和电压过高或偏低。

4.染色

电泳完闭，取出薄膜直接浸入染色液中，染色5 min，然后用漂洗液漂洗，隔l0 min左右换一次漂洗液，直至背景颜色脱去。将膜压在干净的滤纸中，吸去多余的漂洗液。

5.结果判断

经漂洗后一般在薄膜上呈现清晰的5条区带，由正极依次为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白，β-球蛋白和r-球蛋白。（由负极为r-球蛋白、β-球蛋白、α2-球蛋白、α1-球蛋白、清蛋白。）

6.透明

将漂洗后的薄膜用电吹风机吹干，然后浸入透明液甲液中，2 min后立即浸入透明液乙液中，浸泡1 min(时间要准确)，取出薄膜，将其紧贴在载玻片上，不要留气泡。经2～3 min薄膜完全透明，放置10～15 min后，用吹风机吹干，在水龙头下将载玻片上的薄膜润湿，用刀片从膜的一角撬起，将薄膜轻轻撕下，以滤纸吸干水珠，将薄膜浸液体石蜡中约3 min后取出。再用滤纸吸干，压平则成为可长期保存的醋酸纤维膜电泳图谱。

实验结果

按照下述公式计算蛋白质的迁移率。

μ清蛋白=L清蛋白 *d/U*t μα1球蛋白 =Lα1球蛋白 *d/U*t

μα2球蛋白=Lα2球蛋白 *d/U*t μβ球蛋白 =Lβ球蛋白 *d/U*t

μγ 球蛋白 =Lγ 球蛋白 *d/U*t

式中，μ为迁移率[cm2/(V*s)];L为色带中点到点样品之间的距离（cm）；d为纸桥间断开的距离（cm）；μ为电压（V）；t为电泳时间（s）。

注意

1.染色液、漂洗液、透明液应在具塞瓶中密封储存。否则由于易挥发成分的挥发，使组分比例发生变北，会影响实验结果，尤其在高温季节，更要十分注意。

2.平衡后应将平衡装置活塞关某某（或除去平衡管）。

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