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1. 种子的摇瓶培养

种子保藏:

1．50%的甘油：121℃高温灭菌16min，间隔灭菌2次，（灭菌时间过长甘油会发生化学变化，灭菌一次又怕灭菌不彻底，第一次灭菌后，第二天再灭菌一遍）再使用。

2．1 mL 50%的甘油+1 mL菌液，摇匀。

3．-80℃保藏。

注意：发酵培养所使用的种子都为二级种子，即：初始种子摇起来，进行甘油管保藏，多保藏一些，这样可以供多次发酵使用，甘油管保藏不应超过1年，保存时间过长会发生菌株较长每半年或一年对初始菌株进行划线，挑取单某某，LB培养，通过烟草赤星菌的抑真菌实验鉴定菌株抗真菌性状，保某某，作为复壮后的初始菌株。

（2）LB种子活化

LB培养基配置：

酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，配制固体培养基时需加入琼脂8-10 g，定容1L,分装到250 ml的三角瓶中，每瓶100 mL，摇种子备用。121℃（1.034×105 Pa）高压蒸汽灭菌16min。

（3）上罐种子培养

1.培养基母液配制：

铁盐母液配制（1,000 ×）：16 g FeSO4·7H2O，2.1 g EDTA，用ddH2O溶解，定容至1L。

微量元素母液配制（1,000 ×）：2.86 g H3BO4，1.81 g MnCl2·4H2O，0.222 g ZnSO4·7H2O，0.021 g Na2MoO4·2H2O，0.07 g CuSO4·5H2O，用ddH2O溶解，定容至1 L。

CaCl2母液配制（1000 ×）：105 g CaCl2·2H2O，用ddH2O溶解，定容至1L，单独 高压灭菌。

2． Endon-KNO3培养基：

葡萄糖28 g，KNO3 6 g，KH2PO4 1.2 g，MgSO4·7H2O 1.2 g，柠檬酸钠0.2 g，铁盐母液1 mL，微量元素母液1 mL，CaCl2母液1 mL，NaOH调pH7.0。

3．种子培养：

3L Endon-KNO3培养基,分装到1L的三角瓶中，每个三角瓶培养基体积为500 mL。每500 ml接种枯草芽孢杆菌HF1 10 mL。200 rpm，28℃约18h-22h，紫外分光光度计检测OD为0.3-0.4 OD（稀释10倍，OD为3-4OD）之间，作为接种100L发酵罐的种子。

2. HF1 100L发酵罐培养

（1）消泡剂高温灭菌。121℃ 20min

（2） Endon-KNO3培养基高温灭菌：

葡萄糖1.4 Kg，KNO3 300 g，KH2PO4 60 g，MgSO4·7H2O 60 g，柠檬酸钠10 g，铁盐母液50 mL，微量元素母液50 mL，CaCl2母液100 mL，NaOH调pH6.8-7.0 。

100 L发酵罐加入培养基后，121℃灭菌15皿，灭菌结束后，体积为50 L。

（3）100L 发酵罐放大培养操作步骤：

1．溶氧的标定

发酵罐中培养基温度降到28℃后，固定通风量为2.5 L/min，压力为0.1-0.2左右，转速为30% (150 rpm)。标定溶氧为100%。

将3L种子接入到100L发酵罐中。菌初始接入量为0. 2 -0. 25 OD。

2．参数控制

初始发酵阶段：

温度28℃，固定通风量为2.5 L/min，压力为0.1-0.2左右，转速为10% (100rpm)。pH下降到6.6后，氨水调节pH为7.0。

开始阶段菌长速缓慢，溶氧缓慢下降，pH会出现缓慢上升后下降的趋势；

菌体生长阶段：

pH出现快速下降，溶氧下降到30%,逐渐调节转速为20% (120rpm)至40%，在发酵过程中通过 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 放于28℃培养箱中培养。

计算公式：

选择两个连续稀释度平板（每个稀释度至少有一块平板，其上经确证后的枯草芽孢杆菌菌数介于30~300之间），通过式（1）计算，即为1 mL样品中的枯草芽孢杆菌数N：

/

N —— 样品中枯草芽孢杆菌菌数；

∑a —— 所有平板确证后的枯草芽孢杆菌菌数的总和；

V —— 平板的接种体积，单位为毫升；

n —— 第一个稀释度的平板数；

m —— 第二个稀释度的平板数；

d —— 第一个稀释度的稀释因子（未经稀释的液体样品d值为1）。

计算出来的结果保留两位有效数字。

报告每毫升或每克样品的枯草芽孢杆菌估计数，单位为CFU/g（mL）。

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