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免疫组化操作步骤

1.石蜡切片脱蜡至水：

（1）切片厚度：3-5微米烤箱65℃ 2小时

（2）二甲苯脱蜡I、II、III缸,各10 分钟。

（3）梯度酒精：100%*2， 95%*2， 80%*2， 70%*2乙醇各3 分钟，玻片过一次蒸馏水。

2.根据一抗要求，对组织进行相应的抗原修复。(高压加热法暴露抗原)

（1）1:100稀释柠檬酸组织抗原修复液（如配制：修复液10ml+蒸馏水1000ml）

（2）将压力锅放置于电磁炉上，大功率加热至沸腾。将功率调至中度（800-1600w），将切片置于耐高温塑料架上，放入已沸腾的修复液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热。当压力阀开始喷气，开始计时2min，然后将压力锅离开电磁炉。（有时间等待：可以让压力锅自然冷却，等待30分钟-1小时再流水冲洗）（赶时间：可以流水冲洗压力锅外壁加速锅内修复液冷却，打开锅盖流水冲洗冷却后方可取出玻片。）。蒸馏水冲洗3次，每次停留3分钟。

3、过氧化氢封闭内源性过氧化物酶阻断 10分钟

***步骤：每片滴加一滴内源性过氧化酶阻断剂 10分钟

省钱步 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 ml 蒸馏水，试剂ABC顺序加入试剂各50ul，混匀成1ml，DAB显色液。配制好的溶液应避光存放，30min内有效，染色结果为棕色。一般在显微镜下根据颜色的发展情况掌握染色时间。）

8.自来水冲洗2-5min，苏木素复染2-5min，0.1%HCl分化1s，自来水冲洗15min（或氨水1s）蓝某某，切片经梯度酒精脱水70% 80% 90%100%2-3min二甲苯透明3min*2，中性树胶封某某，晾干后观察。

免疫组化-EDTA修复步骤：

石蜡切片脱蜡至水，PBS冲洗3次。

根据一抗要求，对组织进行相应的抗原修复。（EDTA修复：高压锅煮沸后放入玻片，调至最低功率，煮20分钟，待冷却后蒸馏水、PBS 冲洗。）

过氧化氢封闭内源性过氧化物酶阻断 10分钟（蒸馏水洗1次，PBS 3*3min）

加一抗1、室温孵育过午1-2h（至少1小时） 2、PBS 3*3min

5、加二抗室温下孵育15min，PBS 3*3min（按照说明书操作）

6、加DAB显色液

7、自来水冲洗2-5min，苏木素复染2-5min。

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