酶联免疫吸附测定实验
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酶联免疫吸附测定
实验目的
学习酶联免疫吸附测定原理
掌握酶联免疫吸附测定技术，定量测定抗体或抗原。
实验原理
1971 年 Engvall 和Perlmann 发表了酶联免疫吸附剂测定用于1gG定量测定的文章，使得 1966 年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是:使抗原或抗体结合到某种固相 载体表面，并保持其免疫活性。再使抗原或抗体与某种酶连 接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活 性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的 抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表 面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的 抗原-抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上 的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的 底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受 检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或 定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效 果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
试剂和器材
试剂:包被缓冲液（0.05mol/L pH 值为 9.6 的碳酸盐缓冲液）:A 液:0.2mol/L Na2CO3 10.6g，加水至500mL，4℃下保存。B 液:0.2mol/L NaHCO3 316.8g，加水至 500mL，4℃下保存。用时A 液 160mL + B 液340mL，加水至 2000mL。如果需要的话，用 1mol/L HCl 或 1mol/L NaOH 调配 pH 值至 9.6。 清洗液（pH 值为 7.4 的 PBS Tween20 液）:NaCl 8g，KH2PO4 0.2g， Na HPO ·12H O 2.9g，KCl 0.2g。加水至 1000mL，在 1.034×105Pa 高压下蒸汽灭菌 20min。保存于室温。用时加入 Twen20 0.5mL。酶标抗体稀释液（1％牛血清白蛋白，pH 值为 7.4 的 PBS-Tween20）。 底物溶液：TMB（3,3 5,5 -四甲基联苯胺） 终止液: 1mol/L H2SO4
材料:一抗：鼠抗 IL-1β。 抗原（鼠抗 IL-1β）：500pg/mL（用封闭液稀释）。 标记二抗：生物素化鼠抗 IL-1β。HRP 酶标亲和素。
器材:聚苯乙烯微量反应板（40 孔某某 96 孔），可调式微量吸液器 （200μL），封口膜，小烧杯，试管，37℃恒温箱，酶联免疫检测仪。
实验步骤
1.吸附包被抗体 配制包被抗体液。取 1mL 包被缓冲液加一定量一抗，摇匀。吸取包被抗体液，加入 96 孔反应板中的 A1-A8，每孔 100μL，4℃下置冰箱内过夜。 倒去板中溶液，用清洗液洗板 3 次，每孔加 250μL，每次 1min， 在吸水纸上拍打，去净各孔中残留的液体，然后加封闭液每孔 200μ L，盖好盖子并作标记，把酶标板放置 37°培养箱湿盒中孵育 30min 后取出，用清洗液洗板 3 次，每孔加 250μL，每次 1min，拍干。
2.添加抗原和Ⅱ抗 将抗原加到板中各孔中，每孔 100μL，浓度从 A8 到 A3 孔的浓度依次减半，空白对照加清洗液 100μL，将板置湿盒中 37℃下 40min 后取出，用清洗液洗板 3 次，每孔加 250μL，每次 1min，拍干；再将Ⅱ抗加到板中各孔中，每孔 100μL，将板置湿盒中 37℃下 30min 后取出，用清洗液洗板 3 次，每孔加 250μL，每次 1min，拍干。
内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 时应避免孔内液体外溢，以防相邻孔互相污染造成假阳性。 6. 实验中止后在20min内结果有效。 7. 实验过程中操作人员应注意防护。实验废弃物应按传染性样品处理
思考题： 1. 分析酶标抗体不纯对抗原检测结果的影响（双抗体夹心法）
答：酶标抗体不纯，固相免疫复合物上的抗原结合的酶标记抗体减少，加入底物显色后，测量所得的抗原含量小于实际标本中的含量。 2. 比较免疫荧光法和ELISA的最适检测对象 答：免疫荧光法是检测有没有抗体，根据已知抗原（或抗体）推知另一种未知的抗体（或抗原）。适用于细菌、病毒、衣原体、支原体等病原体；ELSIA用于抗原或抗体含量及理化性质的检测，适用于临床方面，血清等。
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