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油红O染色

染色原理：油红O对中性脂质成分具有强亲和力，特别是可以与组织和细胞中的甘油三酯结合形成脂滴状红色圆圈。当使用油红O染料加入到细胞或组织中时，油红O就可以与细胞或组织中的甘油三酯结合形成脂滴，在显微镜下观察呈现红色。

所需试剂：

1）油红 O 储液：试剂配方（1000 ml）： 油红 O 5 g 异丙醇 1000 ml 加热至油红 O 充分溶解，待冷却至室温后滤纸过滤，密封室温保持。在染色之前配置油红 O 工作液，将油红 O 储液与蒸馏水按 3:2 的比例混合均匀，滤 纸过滤后直接使用。工作液每次先用现配，不能重复利用。 2）苏木素染液配方（100 ml）： 苏木素 0.1 g 钾明矾 5 g 碘酸钠 0.02 g 柠檬酸 0.1 g 水合氯醛 5 g 蒸馏水 100 ml 首先，将苏木素加入水中，煮沸使之溶解，在加入钾明矾和碘酸钠，搅拌 直到全部溶解为止。再加入水合氯醛和柠檬酸。完全溶解后染液为蓝紫色。加 热煮沸 5 分钟，冷却后滤纸过滤。此染色液常规染色 30 s—2 min，无需分化， 水洗 2-3 次，使细胞核呈蓝色。3）60%异丙醇脱色液。用蒸馏水配置，先用现配。 4）蒸馏水。 5）甘油封片剂。 本实验中油红 O 染色包括全主动脉油红 O 染色、主动脉根部和肝脏冰冻切 片油红 O 染色及泡沫细胞爬片油红 O 染色，

下面将分别阐述几种染色的方法：

一、全动脉油红O染色的具体实验步骤如下： 1、将分离的主动脉组织在体式解剖镜下小心剥离主动脉外脂肪和其他粘连组织。 2、将主动脉放置于1ml 4%多聚甲醛溶液中固定24h以上。 3、油红O配制：油红O储液与蒸馏水按体积比 3:2 进行稀释，新鲜配置油红O工作液，过滤备用。 4、将整个主动脉放置于24孔板中的一个孔内，加入1 ml油红O工作液，染色 40-60 min。 5、使用60%异丙醇洗去多余染液，直至主动脉部分区域变成白色半透明，斑块区域有明显的红色染色。然后使用蒸馏水冲洗3次。 6、显微镜下再次观察主动脉，将主动脉外被染红的脂肪组织去除干净。 7、Leica体式显微镜下拍照，保存照片。 8、Photoshop软件统计斑块面积和主动脉总面积，计算斑块面积比例。

二、主动脉根部及肝脏冰冻切片油红 O 染色步骤： 1、需要染色的冰冻切片取出后，室温放置 30-60 min，PBS 浸泡 5 min。 2、油红 O 配制：油红 O 储液与蒸馏水按体积比 3:2 进行稀释，新鲜配置油 红 O 工作液，过滤备用。 3、将配置好的油红 O 工作液倒至染缸，切片直立放置，油红 O 工作液全部 没过切片组织块，染色 40-60 min。 4、脱色，使用 60%异丙醇洗去多余染液，将切片在 60%异丙醇脱色液中蘸 几次，不要过度脱色。 5、复染，将切片放至苏木素染缸中染色 30 秒左右，蒸馏水洗 5 min×3 次。 6、Leica DM5000B 显微镜拍照，保存照片。7、Photoshop 软件统计斑块面积和主动脉总面积，计算斑块面积比例。

三、泡沫细胞油红 O 染色的具体实验步骤如下： 1、小鼠原代细胞获得： 将小鼠处死后在超净台内将用 75%乙醇消毒两次。用剪刀将老鼠腹部剪开 一个小口，撕开皮肤，暴露腹膜。用大号注射器向小鼠腹腔内快速注入 7 ml 室 温无菌 1×PBS，轻轻晃动几下使腹腔巨噬细胞充分悬浮于 PBS 中，最后将 PBS 尽可能完全吸出置于 15 ml 灭菌离心管中。在原针眼处再重复此操作一次。1500 rpm 离心 5 min。 2、铺片。将合适大小约 12 mm 的无 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 min充分裂解混入的红细胞，再于1300 rpm下离心3 min后抽弃上清，用RPMI 1640培养基（含20 ng/mL M-CSF）重悬细胞、铺板，每三天换培养基一次，换液时收集原培养基，1300 rpm离心3 min，抽弃原培养基的三分之二，补入新鲜培养基（含20 ng/mL M-CSF）至之前体积，重悬细胞并将其放入到之前的培养皿中继续培养，诱导细胞分化；一周后大部分单核细胞即被诱导分化成巨噬细胞并贴壁，用无菌PBS溶液清洗细胞以去除未贴壁细胞，之后即可进行药物处理。

骨髓巨噬细胞和腹腔巨噬细胞的区别：

骨髓中为单核细胞，需要M-CSF进行诱导得到巨噬细胞。腹腔里面就是巨噬细胞

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