分离线粒体试验方法
以下为《分离线粒体试验方法》的无排版文字预览，完整格式请下载
下载前请仔细阅读文字预览以及下方图片预览。图片预览是什么样的，下载的文档就是什么样的。
１．２．１提取线粒体ＤＮＡ邋（ｍｔＤＮＡ）逡逑
１）分离线粒体：采用邋Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ邋Ｆｒｅｚｚａ邋（Ｎａｔ邋Ｐｒｏｔｏｃ．邋２００７；２（２）：２８７－９５．）描述方法，主要步骤包括：①准备预冷ＰＢＳ和ｆｆｉｃ，将己禁食１２小时的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠放血处死，取出小鼠肝脏，去除胆囊，先用预冷ＰＢＳ漂洗一遍后，用５０ｍｌ预冷的ＩＢｃ缓冲液漂洗５至６遍，直至漂洗液无明显血色。②用组织剪将肝逡脏剪碎（在冰上操作），滤去原ＥＢｃ，加入５ｍｌ新鲜预冷ＩＢｃ，将肝组织悬液转移至己预冷玻璃匀浆器中，均浆数次，直至液体均一、无明显组织块。③将肝组织匀浆液转移至１５ｍｌ离心管，６００ｇ，邋４°Ｃ，离心ｌＯｍｉｎ；尽量吸净上清，转移至新的１５ｍｌ离心管中，６００ｇ，邋４°Ｃ，离心ｌＯｍｉｎ；将上清转移至新的１５ｍｌ离心管中，尽量避免吸到下层沉淀；７０００ｇ，４°Ｃ，离心ｌＯｍｉｎ；弃上清，用５ｍｌ预冷的ＩＢｃ重悬并漂洗沉淀；７０００ｇ，４°Ｃ，再次离心ｌＯｍｉｎ；弃上清，沉淀即为线粒体。逡逑
２）所得线粒体沉淀按照每个肝脏加５００叫缓冲液ＧＳ，重悬线粒体，用于进一步逡逑
提取ｍｔＤＮＡ。采用血液基因组ＤＮＡ提取试剂盒分别ｍｔＤＮＡ，具体步骤包逡逑
括：将线粒体用２００ｕｌＰＢＳ重悬，加入２００邋Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ邋Ｋ溶液，充分混匀；加入２００ｕｌ缓冲液ＧＢ，充分颠倒混匀，５６°Ｃ水浴ｌＯｍｉｎ；加入２００＾１无水乙醇，颠倒混匀后快速离心，使管壁液体脱离，将所得溶液全部转移入吸附柱逡逑ＣＢ３，邋１３４００ｇ，室温，离心３０ｓ，弃收集管某某废液，将吸附柱ＣＢ３重新放入逡收集管某某；向吸附柱ＣＢ３中加入５００叫缓冲液ＧＤ，１３４００ｇ，室温，离心３０ｓ，弃收集管某某废液，将吸附柱ＣＢ３再次放入收集管某某；向吸附柱ＣＢ３中加入逡逑
７００ｕＴ漂洗液ＰＷ，邋１３４００ｇ，室温，离心３０ｓ，弃收集管某某废液，将吸附柱ＣＢ３放入收集管某某；用５０００的漂洗液再次漂洗离心后弃收集管某某废液，将吸附逡逑
柱ＣＢ３重新置于收集管后，１３４００ｇ，室温，离心２ｍｉｎ，弃收集管某某废液，逡逑
将吸附柱ＣＢ３室温放置３－５分钟以挥发乙醇，但应避免吸附膜干燥；将吸附逡逑
柱ＣＢ３转入新的１．５ｍｌ邋ＥＰ管中，向吸附膜中间位置悬空滴入５０＾１７０°Ｃ预热逡的ｄｄＨ２０以洗脱ｍｔＤＮＡ，室温放置５ｍｉｎ，１３４００ｇ，室温，离心２ｍｉｎ，邋ＥＰ逡管某某所得即为ｍｔＤＮＡ；吸出ｍｔＤＮＡ保存，并重复洗脱步骤２次，重复上述逡逑步骤。逡逑
３）线粒体检测：检测ｍｔＤＮＡ浓度和纯度：得到的ｍｔＤＮＡ溶液按照１：邋２０稀逡逑释后，采用分光光度计检测其浓度和ＤＮＡ纯度，保证ＯＤ２６０／２８０在１．８至逡逑２．０之间；以小鼠１８Ｓ为内参基因，利用小鼠ｍｔＣＯＩ和小鼠１８Ｓ特异性引逡逑
物，采用ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ荧光定量ＰＣＲ检测提取所得ｍｔＤＮＡ溶液中ｍｔＤＮＡ逡逑和核基因组ＤＮＡ水平。根据ｒｅａｌｔｉｍｅ邋ＰＣＲ所得出的小鼠ｍｔＣＯＩ和小鼠１８Ｓ的Ｃｔ值及２－ＡＣｔ方法计算出该ｍｔＤＮＡ溶液中核ＤＮＡ的含量，保证基因逡组ＤＮＡ比例小于０．１％．逑
（1）线粒体邋ＤＮＡ邋（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ＤＮＡ，ｍｔＤＮＡ）逡逑
与基因组ＤＮＡ截然不同的是，人ｍｔＤＮＡ为超螺旋、双链、环状ＤＮＡ分逡子，总长Ｉ６５６９ｂｐ，两条ＤＮＡ链分别为重链（Ｈ链）和轻链（Ｌ链），共编码３７个基因，包括２种ｒＲＮＡ邋（１６ＳｒＲＮＡ、１２ＳｒＲＮＡ）、２２种ｔＲＮＡ和１３种蛋白逡逑质亚基［４５］。一般情况下，线粒体内ｍｔＤＮＡ与转录因 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 膜为主［５０］。由于基因组ＤＮＡ含有低频率、高甲基化ＣｐＧ重复序列，并很少进入溶酶体，因此一般生理情况下，ＴＬＲ９处于非激活状态。ＴＬＲ９向溶酶体膜转逡逑移是ＴＬＲ９活化的必要条件［５１］，因此细胞损伤、坏死、氧化应激等情况下释放逡逑入细胞外的ｍｔＤＮＡ首先促进ＴＬＲ９由ＥＲ向溶酶体转移，其后再与ＴＬＲ９结合，逡促进下游ＭＡＰＫ的活化。ＴＬＲ９的激活可以促进Ｍｙｄ８８邋＋邋Ｍａｉ邋ＩＲＡＫ邋＋ＴＲＡＦ６邋ＴＡＢ、ＴＡＫ１激活，后者一方面可进一步与ＩＫＫ作用，促进ＮＦ－ｋＢ转录因子的活化，另一方面可促进包括ｐ３８、ＥＲＫ和：ＷＫ等在内的多种ＭＡＰＫｓ逡激活［５２］。逡
/
/
/
/
/
/
[文章尾部最后300字内容到此结束,中间部分内容请查看底下的图片预览]请点击下方选择您需要的文档下载。
以上为《分离线粒体试验方法》的无排版文字预览，完整格式请下载
下载前请仔细阅读上面文字预览以及下方图片预览。图片预览是什么样的，下载的文档就是什么样的。