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第二部分 细胞实验

（1）中性粒细胞培养

将购买的嗜中性粒细胞进行常规解冻，DMEM高糖培养基+10%FBS在5%CO2 37℃条件下悬浮培养。

（2）诱导中性粒细胞形成NETs

采用PMA诱导法。将备用中性粒细胞密度调至1.5*105/孔，接种于多聚赖氨酸包被盖玻片上，置入24孔板中，5%CO2浓度37℃细胞培养箱中稳定30分钟。将丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）以5umol/ul的浓度加入中性粒细胞培养皿中，放入细胞培养箱中刺激4小时，在培养皿中加入Picogreen荧光染料进行标记，荧光显微镜下观察NETs形成。

（3）NETs的提取

PMA刺激中性粒细胞4小时后，移液枪轻吸出培养基并丢弃，用预冷的Hanks液冲洗培养皿底部，收集洗涤物在4℃ 450×g离心10分钟，弃上清后再次使用Hanks液重悬（每100ulPBS对应1×106/ml中性粒细胞），使用微量核酸蛋白检测仪测量重悬液中DNA浓度。

（4）腹蛇蛇毒粗毒液蛋白质浓度测定

粗毒液样品的蛋白质含量用改良的Bradford法测定。测定方法按照Bradford蛋白质定量试剂盒说明书进行。将蝮蛇蛇毒冻干粉加入PBS后充分溶解，4℃，5000转/分钟×15分钟离心，以去除不溶性物质，取上清液用0.22um的滤膜过滤除菌，制备得到1mg/ml的蛇毒母液，-20摄氏度保存。将0、10、20、30、40、50、60ul牛血清白蛋白（BSA）标准溶液（1mg/ml）分别加入到试管中，再加入PBS补足到150ul，取蛇毒稀释液10ul加入到试管中并再加入PBS补足到 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 加含有0.05%DAB（3,3-二氨基联苯胺，Sigma-Aldrich）试剂和0.024%过氧化氢（H2O2，Thermo Fisher Scientific）的底物溶液后，对膜进行成像。选择定量最高的蛇毒蛋白作为主要蛇毒蛋白。

（7）间接酶联免疫吸附法检测NETs作用前后主要蛇毒蛋白与抗蛇毒血清结合物含量

4℃预冷酶标板，用移液器对筛选出的5ng蛇毒组分预涂于酶标板后将平板拍干，并用TBST冲洗5次。观察组分为蛇毒预孵育组、血清预孵育组和共同预孵育组。蛇毒预孵育组将NETs重悬液直接加入抗原包衣孔某某预孵育30分钟后用TBST冲洗1次，再加入100ul适当稀释的抗蛇毒血清（1:6000）继续孵育1小时；血清预孵育组为将NETs重悬液先与抗蛇毒血清预孵育30分钟后，再将预孵育后的抗蛇毒血清加入抗原包衣孔某某继续孵育1小时；共同孵育组为将NETs重悬液50ul、抗蛇毒血清（1：3000）50ul加入后孵育1小时。对照组将100ul适当稀释的抗蛇毒血清（1:6000）添加到每个抗原包衣孔某某孵育1小时。两组孵育完成后，继续用TBST清洗平板5次，将100μL适当稀释的辣根过氧化物酶结合抗马IgG添加到孔某某，室温下孵育1小时。继续用TBST洗涤5次，去除多余的组分，每孔加入100ul新鲜制备的基质溶液（0.5 mg/mL邻苯二胺和0.003%过氧化氢，0.1 M柠檬酸磷酸盐缓冲液，pH 5.0）后避光室温下孵育15min。再加入50ul的12.5%硫酸，终止反应，用酶标仪读取492 nm处的吸光度。实验重复3次。

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