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间标流式细胞术实验方案

间接标记需要两个孵育步骤，首先用一抗孵育，然后再用相应的二抗孵育。二抗（而非一抗）偶联荧光染料（FITC、PE、Cy5?? 等）。请注意，该方案仅为通用实验方案，您可能需要根据具体的应用进行调整。

一般程序：

1. 收集并洗涤细胞，然后测定细胞总数。通常在12 x 75 mm2 大小的聚苯乙烯圆底Falcon离心管中对细胞进行染色。但是，若有合适的离心设备，细胞染色可在任何容器中进行，例如试管、微量离心管和 96 孔圆底微量滴定板。一般说来，应该尽可能地加快离心速度，保证去除上清液时的细胞损失较小，但是如果离心速度过快会导致细胞难以重悬。通常需要检查细胞活力是否在 95% 左右且不低于 90%。

2.在含 10% FCS、1% 叠氮化钠的冰冷 PBS 溶液中重悬细胞至约 1-5 x 106 细胞/mL。

请使用冰冷的试剂/溶液，并且将细胞保存在 4 ℃ 的低温环境下，因为低温和叠氮化钠的存在可以抑制表面抗原的调节和内化作用，避免了荧光强度的降低。 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 胞仪的时间，可使用 1% 多聚甲醛重悬细胞以防止变质。

固定：

如果分析之前的等待时间超过 1 小时，您可能需要在第 5 步后固定细胞。此操作可使细胞保留数天（可以使光散射稳定并使大部分有生物危害的试剂失活）。对照组需要通过相同的程序进行固定。如果细胞需要保持活力，则不应固定。固定细胞的方法有多种。操作人员需要对不同抗原的固定进行调整优化。

1.每份样品中加入 100 μL 0.01% 至 1% 的多聚甲醛固定 10-15 分钟。

2.丙酮或甲醇：

N/B 聚苯乙烯//塑料管不适用于丙酮

向每份样品中添加 1 mL 冰冷的丙酮。轻轻混匀。在 -20 ℃ 下静置 5-10 分钟。离心，然后用含 1% BSA 的 PBS 洗涤两次。

如果您希望恢复细胞功能，例如要收集细胞进行功能研究，请勿向缓冲液中添加叠氮化钠。这种试剂会抑制代谢活动。

如果不需要表面染色或表面染色蛋白对胰蛋白酶消化具有抗性，可以使用胰蛋白酶。由于我们测的是细胞表面的PD-L1，所以不能用胰蛋白酶进行消化。

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