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大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

　　　 电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010?转化子/μg DNA。

3.1．感受态细胞的制备

（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。

（2）选合适的大肠杆菌在4℃，2000 xg下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。（离心机提前预冷）

（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O清洗一次，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，2000 xg离心10 min。

（4）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，2000 xg离心10 min。

（5）小心 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。

（4）将电极杯推入电转化仪中，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800 μL的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5 mL的离心管中。

（5）37℃，220～250 rpm复苏40 min。

（6）按照钙转步骤进行涂板培养。

【电击杯清洗流程】

（1）用清水将电击杯稍冲一下。

（2）向电击杯中加入75%酒精浸泡2h。

（3）去酒精，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用1mL的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。

（4）加入无水乙醇2mL于电击杯中，浸泡30min。

（5）去无水乙醇，于通风厨内挥发干乙醇。

（6）将清洗好的电击杯放入－20℃冰箱内待用。

【注意】不同样品使用的电转化杯应分开；若长期不用，应将清洗好的电转化杯浸泡在乙醇中。

华中农业大学农业微生物学国家重点实验室

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