1_微孔板荧光法测定土壤酶活性实验
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微孔板荧光法测定土壤酶活性
1、实验原理
4-MUB或7-AMC在365 nm波长处激发，能在450nm处检测到荧光，它与某些物质结合荧光特性消失, 通过酶的水解作用将 MUB/AMC释放出来, 通过检测荧光量表征酶活性。（AMC：丙氨酸酶底物、亮氨酸酶底物、MUB：β-葡萄糖苷酶、N-乙酰氨基-β-葡萄糖苷酶、芳基硫酸脂酶、磷酸酶、纤维素酶、β-木糖苷酶）
3、试剂配制
缓冲液配制：
50mmol/L醋酸钠缓冲液：（6.804g三水合醋酸钠溶于1升水中，用氢氧化钠或醋酸调节ph，一般黄绵土酶活性可调节ph至8.5左右）
酶底物配制：
200umol/L丙氨酸酶底物（CAS:77471-41-1）:0.0049g溶于100ml缓冲液 M=246.26
亮氨酸酶底物（CAS：62480-44-8）：0.0065g溶于100ml缓冲液M= 289.3495
β-葡萄糖苷酶（CAS:18997-57-4）: 0.0067g溶于100ml缓冲液M=338.3093
N-乙酰氨基-β-葡萄糖苷酶（CAS：37067-30-4）：0.0076g溶于100ml缓冲液M=379.36
芳基硫酸脂酶（CAS：15220-11-8）：0.0059g溶于100ml缓冲液M=236.27188
磷酸酶（CAS:3368-04-5）: 0.0051g溶于100ml缓冲液M=256.15
纤维素酶（纤维二糖水解酶）（CAS：72626-61-0） 0.0100g溶液100ml缓冲液M=500.45
β-木糖苷酶（CAS:6734-33-4）：0.0062g溶于100ml缓冲液
4、标样
10umol/L四甲基伞形酮（CAS:90-33-5）：0.1762g溶于100ml甲醇溶液中，后吸取1ml用缓冲液定容到1L； M=176.17
10umol/L七甲基香豆素（CAS:26093-31-2）：0.1752g于100ml甲醇溶液中，后吸取1ml用缓冲液定容到1L。 M=175.18
5、称样震荡
称取1g土壤置于200ml塑料瓶，加入125ml醋酸钠缓冲液，震荡1h。
6、酶标板加样：
样品反应孔：加震荡悬浊液150μL+50μL酶底物
空白微孔：震荡悬浊液150μL+50μL醋酸铵缓冲液（ck）fb
阴性对照：缓冲液150μL+50μL酶底物（酶CK）fs
淬火标准微孔：50μL标准物质+震荡悬浊液150μL（amc mub）fq
参考标准微孔：50μL标准物质+150μL 醋酸缓冲液(amc大CK)fr
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A
底+样1
底+样1
底+样9
底+样9
缓+样1
缓+样9
标+样1
标+样1
标+样9
标+样9
标+缓
标+缓
B
底+样2
底+样2
底+样10
底+样10
缓+样2
缓+样10
标+样2
标+样2
标+样10
标+样10
标+缓
标+缓
C
底+样3
底+样3
底+样11
底+样11
缓+样3
缓+样11
标+样3
标+样3
标+样11
标+样11
底+缓
底+缓
D
底+样4
底+样4
底+样12
底+样12
缓+样4
缓+样12
标+样4
标+样4
标+样12
标+样12
底+缓
底+缓
E
底+样5
底+样5
底+样13
底+样13
缓+样5
缓+样13
标+样5
标+样5
标+样13
标+样13
F
底+样6 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 壤样品的酶活性(umol·g－1·h－1)；F为校正后的样品荧光值；V 为土壤悬浊液的总体积(125 mL)；V1 为微孔板每孔中加入的样品悬浊液的体积(0.2mL)；t为暗培养时间(4 h)；m为干土样的质量(1g 鲜土样换算成干土样的结果)；f为酶标仪读取样品微孔的荧光值；fb为空白微孔的荧光值；q为淬火系数；f s为阴性对照微孔的荧光值；e为荧光释放系数；fr为参考标准微孔的荧光值；Cs为参考标准微孔的浓度(10 umol·L－1)；V2为加入参考标准物的体积(0.00005 L)；fq为淬火标准微孔的荧光值。
反应的底物浓度S=F/e
标+缓
标+缓
底+缓
底+缓
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