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实时荧光定量（RT-qPCR）原理篇

RT-qPCR的全称是实时荧光定量（Real?Time Quantitative PCR），属于是第二代PCR技术。与常规的PCR技术相比，RT-qPCR可对DNA起始模板进行定量，同时可以对整个扩增反应进行实时监控。

RT-qPCR根据反应体系中加入的荧光基团所积累的荧光信号强度变化，对PCR反应中的每一个循环扩增产物进行实时监控。其基本原理包括反应的化学原理和定量的数学原理。上一期的『i实验』，小编向大家介绍了RT-qPCR的化学原理，本期『i实验』，小编向大家介绍了RT-qPCR的数学（定量）原理。

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在介绍qPCR的定量原理之前，我们先明确几个重要的概念。

扩增曲线

随着扩增反应的进行，扩增产物不断的累积，荧光信号也不断在增加。系统每进行一个循环就会采集一次荧光信号，经过一定的循环数后，就可以得到下面的扩增曲线图。（横坐标代表扩增的循环数cycle，纵坐标代表荧光的强度）。?

从下图可以看出，随着反应的进行，PCR的扩增曲线呈现出“S”型。扩增反应分成3个阶段：基线期、指数扩增区和平台区。

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一般来说，前15个循环内产生的荧光信号大多是背景的信号，产物量较低，此时体 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 的反应中，反应体系中的dNTP、酶等都在不断的消耗，导致产物的数量并不符合Xn=X0?×2n?。我们可以将理想状态下的PCR扩增公式修改为：

Xn=X0?×(1+En)n

引入的参数En表示扩增的效率。当En为100%时，实际PCR扩增产物的量等于理想情况下的量。

刚刚我们介绍到，当扩增产物达到荧光阈值时所经历的循环为Ct，将Ct带入公式：

Xct= X0?×(1+En)ct?=M

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通过上图，我们可以看出，当阈值设定好之后，Xct为一常数，将其表示为M。此时，将方程两边同时取对数即为

LogM=LogX0?×(1+En)ct?

整理后：??LogX0?= LogM- Ct?Log(1+En)

我们知道，起始模板的量越多，达到荧光阈值的Ct值就越小，反之越大。

通过观察整理后的公式，我们可以发现起始模板的对数值与Ct值是线性关系。因此，我们只需要两个不同的Ct值，即可以得到方程中每个参数的值。用两个已知浓度的模板和未知浓度的模板进行同一个反应，先求出三者的Ct值，在用已知浓度的模板拟合出线性方程，求出未知浓度的模板的起始量。

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通过线性关系的斜率还可以得到扩增反应的扩增效率，以便对结果进行修订。

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