探究性实验实施
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探究性实验实施
探究性实验课程的目的是为了能充分调动学生的学习主动性、积极性和创造性，并把所学得的基础医学知识综合地应用于课题的立项、设计、实施、结果分析和论文撰写。 探究性实验根据其实验自行设计程度和时间跨度可分为平台性扩展设计实验和自行设计实验二类。
第一节 自行设计性实验
自行设计性实验是指在教师的指导下，学生通过在一段时间内对文献进行复习与查阅，寻找同学感兴趣的研究内容，自行设计性实验方案，完成实验操作、观察和分析实验结果、实验课题汇报等全过程。自行设计性实验持续时间较长，约二个学期。在自行设计性实验过程中，学生可以充分地利用实验室或教研室提供的电生理学、血流动力学、呼吸力学、细胞生物学和分子生物学等仪器设备。同时，进一步培养了学生的开拓与创新精神，养成良好的科学精神和严谨务实的科学作风。
一、文献查阅、综述写作
（一）文献查阅
（1）以实验小组为单位，根据已学的基础知识和近期将要学习的知识，利用图书馆专业期刊及 Internet网查阅相关的文献资料，提出各自感兴趣的研究方向和内容。
（2）在教师的指导下，经过小组集体酝酿、讨论，凝练一个共同的研究目标与内容。
（二）综述写作
（1）围绕一个共同的研究目标与内容，通过小组内成员的答辩与讨论产生综述写作的主笔同学，并合理分配每个同学在查阅文献与综述写作中的任务。
（2）通过文献查阅，了解本研究内容的国内外现状，写出实验课题的背景综述或文献综述（包括涉及研究所需的材料、设计与实验方法）。
（3）在文献查阅过程中，每个小组需定期进行文献阅读汇报会（2～3次），加深对课题的研究方向的理解和把握，增强自主学习和终生学习的能力。
（4）在完成背景综述或文献综述基础上，确定研究方向中的某个论点或热点，由1～2个同学主笔完成发表综述的写作。
（5）发表综述应严格按照刊物的要求进行撰写，力争公开发表。
二、立题与课题标书
（一）立题
（1）经过小组集体酝酿、讨论，确立一个既有科学性又有一定创新的课题。
（2）指导老师对课题的目的性、科学性、先进性、创新性和可行性进行初审，必要时可通过预实验进行实验方案论证。
（二）课题标书
（1）明确课题研究的目的、意义和研究内容，了解国内外研究现状、水平和发展趋势。
（2）制定较为清晰的研究方法、技术路线、时间接点和可行性分析。
（3）课题组长应组织小组成员在老师指导下，按照基***大学生自然科学研究基金项目的要求完成课题标书填写任务。
三、实验方案设计
（一）方案设计
1．方案设计原则
在立题基础上，依据文献资料和预实验结果认真地按照规定的格式写出实验操作的设计方案。设计方案的内容应详细并具可操作性。
2．具体格式要求：
（1）题目，班级、设计者。
（2）立题依据（研究的目的、意义，以及欲解决的问题和国内外研究现状）。
（3）实验动物或细胞的品系、规格和数量。
（4）实验器材与试剂：器材名称、型号、规格和数量；药品或试剂的名称、规格、剂型和使用量，包括特殊仪器与药品需要。
（5）实验方法与操作步骤：包括实验的技术路线、实验的进程安排、每个研究项目的具体操作过程，以及设立的观察指标和指标的检测手段。
（6）实验日程安排与进度的控制节点。
（7）观察结果的记录表格制作。
（8）预期结果。
（9）可能遇到的困难、问题及解决的措施。
（二）实验准备
根据实验的设计方案列出实验所需的动物、细胞株、器械、药品、试剂等预算清单，在实验前两周提交指导老师。对一些特殊药品或试剂应列出供应***名称。
四、开题报告
1．由基***组织开题报告，邀请相关领导和专家参加评审。
2．课题小组应在组长领导下，选好主汇报人，做好多媒体汇报材料，同时小组每个成员都要积极做好准备，接受其他同学、专家和领导的询问。
3．开题报告后，应认真总结，发现问题和修正方案。
五、预实验、结果分析、正式实验
（一）预实验
（1）按照实验设计方案和操作步骤，认真进行预实验。
（2）实验过程中，做好各项实验的原始记录。
（二）结果分析
（1）应及时整理实验结果，发现和分析预实验中存在的问题和改进与调整的实验方案。
（2）对实验出现与预期结果不同时应及时向指导老师进行汇报。
（3）如果指导老师认为预实验已基本达到目的和要求时，可不再进行正式实验。
（三）正式实验操作
（1）依据修改后的实验设计方案和操作流程认真地进行正式实验。
（2）做好各项实验的原始记录，及时整理分析实验数据。
（3）对一些实验试剂成本昂贵、实验操作难度较大，以及环境不允许的实验可由教师亲自完成。
六、论文撰写
1．在认真完成实验数据的整理与分析后，按***校的学报格式进行论文撰写。
2．实验小组的每个成员按照自己对实验数据的认识，以及对本课题研究意义的不同思考，可独立完成一篇论文撰写。实验小组在讨论后应共同完成一篇论文撰写。
3．根据老师要求时间节点上交论文，力争公开发表。
七、课题汇报
1．在指导老师修改下，小组每个成员共同完成多媒体制作，做好论文答辩准备工作。
2．实验小组通过协商产生一名同学作为主答辩人，其他同学共同参与，组成论文答辩队。
3．在论文答辩过程中，应体现事实求实，尊重实验结果和良好的科学态度，以及缜密的思维模式和优秀的表达艺术。
4．由指导老师和专家组成的答辩委员会及其他同学将对研究论文汇报结果进行提问。并由答辩委员会对整个研究课题的科学性、先进性、创新性，论文撰写、汇报的表达能力进行综合打分，给出最终成绩。
第二节 扩展性设计实验
多学科扩展性设计实验是指由教师指定的实验平台条件下，完成从实验设计、实验操作到结果分析与论文撰写全过程。实验操作过程基本在一次实验课内完成，然后再安排一次以小组为团队的结果汇报与讨论。例如，以家兔失血性休克作为自主设计实验平台，学生可自主设计休克实验方案，包括失血程度，抢救措施（药物施加的方式），实验观察指标的设立。设计方案经指导教师同意后，在实验课完成实验操作和结果分析等过程，并用多媒体汇报与讨论实验结果。
一、基于家兔为实验对象的多学科整合性扩展设计
（一）实验目的
以哺乳动物家兔为实验对象，依托PowerLab实验系统，多参数多器官系统实验同时开展，进行多功能学科（正常生理、病理生理和药理）的整合性实验。在扩展实验中同时采样记录动物的心血管系统、呼吸系统、泌尿系统等多系统参数，各系统参数的有机组合，辅以各种实验手段和措施（如人为建立病理模型，病理模型的药物治疗等），可明确所设计课题中动物的正常生理过程，病理变化和药物治疗效果。
（二）实验原理
疾病的发生必然伴随着相应的生理过程的变化。PowerLab实验系统使多参数同步记录的可能得以实现。记录此生理参数，可直观地反映机体从正常生理情况转变为病理生理的过程，以及反映药物对疾病的治疗情况。
（三）实验条件
1．实验动物
家兔，体重 1.5～2.0 kg。
2．药品与器材
基础实验中用于家兔实验的所有药品和器械。
（四）实验基本过程
根据设计实验的步骤而变化
（五）讨论分析
（1）对实验目的、原理进行阐释，实验结果进行总结与归纳。
（2）对实验中出现的各种观察指标变化进行分析，探讨其变化的发生机制。
（3）如实验结果不理想，请分析其失败的原因和提出改进的措施。
（六）时间节点
（1）完整、详细的实验设计方案必须在实验课的前一周完成，设计方案不合格者将取消实验资格。
（2）实验操作时间必须控制在1天以内。
（3）一周后以小组为单位用多媒体汇报实验结果和讨论分析。
（七）附录及注意事项
1．家兔正常生理指标（见第二章）
2．所需参数参见相应的基础实验。
3．仪器连接参见各相应参数记录时的实验。
4．实验过程不得危害人体健康和污染环境。
（王某某）
二、基于多因素对离体心脏功能影响的扩展性实验
（一）实验目的
离体心脏灌注是指将动物心脏取出胸腔，连接上一个特定的灌流装置，用相应的缓冲液灌注其冠脉系统，使离体心脏在人工控制的条件下自主跳动或人工起搏下收缩与舒张。自主设计多因素对大鼠离体心脏功能影响的实验，并观察心脏在不同条件下的功能变化规律。
（二）实验原理
离体心脏模型主要分为两种：主动脉逆行灌注（Langendorff）模型和工作心脏模型(Working heart)。这种模型的主要优点是不受神经，体液的调节，影响因素少，而且可控性强（如前负荷、后负荷、营养液成分、温度等均可调节）。因此，离体心脏模型广泛运用于医学各领域生理，药理、生化等基础与临床相关科室的研究领域。
（三）实验条件
1．实验动物
大白鼠，体重200～300 g左右。
2．药品与器材
戊巴比妥钠，Krebs-Henseleit缓冲液，主动脉插管，灌流槽，恒温灌流装置，微电极放大器，哺乳动物手术器械，台某某，PowerLab 8S主机，微操纵器，冷光源，含95% O2+5% CO2混和气体。
（四）实验基本过程
自主设计各种不同试剂或药物观察对心脏功能的影响。
1．主动脉逆行灌注（Langendorff，逆行灌注，retrograde perfusion）
（1）取大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉，舌下静脉注射1％的肝素抗凝（0.5ml/kg）（腹腔注射亦可，5000 IU/kg），开胸迅速取出心脏置于4℃或室温下的Krebs-Henseleit缓冲液。
（2）心脏自主收缩与舒张可排出心腔内大部分血液，立即用两眼科镊持主动脉，接上主动脉插管，此管道通过一调节拴连接入可以调节灌注压的灌注管道。
（3）心尖部挂一个金属小钩连接生物信号转换仪，可以测量心率，心功能。整个灌注系统及心脏周围用恒温水浴循环器维持在37℃左右。
（4）将一与PE管连接的水囊由左房插入左心室，PE管接压力换能器至MPA生物信号记录系统，调节水囊内压至5~10 mmHg（前负荷），通过水囊可以测定左室发展压（developed pressure）及dp/dt。
（5）灌流液储槽内常用Krebs-Henseleit液（NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO4 1.2，MgSO2 1.2，CaCl2 2.9，NaHCO3 25，Glucose 11.1，EDTA 0.5 mmol），灌注液以95％的O2 和5％的CO2充分饱和，使氧分压维持在500－550mmHg，二氧化碳分压维持在36－42mmHg左右，pH值7.38-7.46左右，灌注压一般在90cmH2O。
（6）心脏恢复自主心跳后平衡灌注15min，待心脏跳动平稳后便可开始实验。
（7）在药物实验中，可以将药物直接加入储槽内，或用微电脑输液泵从主动脉根部给药。挥发性药物（如挥发性麻醉药）可以使灌注液在一定浓度下饱和该药物，再行灌注。
Langendorff灌注最大的优点是简单而且相对稳定（只要灌注压和灌注液恰当）。然而，它不完全符合生理，其本质是主动脉逆行灌注，心脏是空收缩，没有起到泵的作用，而且没有前负荷。将一水囊置于左心室，使心脏有了一些前负荷，另外通过水囊还可以测定左室发展压（developed pressure）及dp/dt，但这种模型心脏做功较少，在测定心肌代谢方面还很困难。这是因为水囊大小是固定的，与心室内壁结合不会太紧密，因此，与生理状态下的前负荷相差较远。
2．工作心脏模型（Working Heart，顺行灌注，antegrade perfusion）
此模型的最大特点是左室有了可以调节的前负荷，这样，心脏就能和在体模型一样做功，而且在测量心脏能量代谢和心肌酶谱方面和在体模型接近。
（1）动物及灌流液同Langendorff模型，与Langendorff模型不同的是，工作心脏模型是一种双灌流装置，它不仅有主动脉灌流系统而且还有左房灌流系统，主动脉流入道和流出道通过三通连接互相转换，流出道的压力（后负荷）可以通过管道内液平面高度来调节。前负荷可以调节左房灌注系统储槽的液面高度。
（2）操作的前半部分同Langendorff模型，在实行完主动脉逆行灌注后行肺静脉插管入左房连接左房灌流系统，结扎固定。
（3）由心尖部向左室插入一充满营养液的PE管，连接换能器至生物信号转换仪，可以测量左室内压变化及心率。
（4）持续主动脉逆行灌流10min待心脏搏动平稳后，关闭主动脉流入道，打开主动脉流出道，并开始心房灌流，预灌流15～20min，待心跳平稳后开始实验。
（五）观察项目
自行设计多因素影响离体心脏的观察项目或心功能指标。
（六）讨论分析
（1）对实验目的、设计原理进行阐释，实验结果进行总结与归纳。
（2）对实验中出现的各种观察指标变化进行分析，探讨其变化的发生机制。
（3）如实验结果不理想，请分析其失败的原因和提出改进的措施。
（七）时间节点
（1）完整、详细的实验设计方案必须在实验课的前一周完成，设计方案不合格者将取消实验资格。
（2）实验操作时间必须控制在1天以内。
（3）一周后以小组为单位用多媒体汇报实验结果和讨论分析。
（八）注意事项
（1）主动脉悬挂结扎的位置不能太深，以免阻塞冠状动脉入口或损伤主动脉瓣造成关闭不全。
（2）在整个实验过程中要注意保持心脏周围温度37℃左右，上下波动不超过0.5℃
（3）灌流液事先要用氧气充分饱和，一般为20～30min。
（4）灌流液经心脏冠脉循环后由冠状静脉窦流入右心房及右心室，最后从肺动脉流出，因此，在操作中如果结扎了肺动脉，会出现右室迅速彭出的情况或将。
（陈红）
三、大鼠离体主动脉血管功能的扩展性实验
（一）实验目的
通过离体主动脉血管张某某变化记录观察血管的收缩功能与舒张功能。如果采用动物疾病模型，如遗传性高血压动物可以观察到血管内皮或平滑肌功能损伤。
（二）实验条件
1．实验动物
大白鼠。
2．药品与器材
戊巴比妥钠，Krebs-Henseleit缓冲液，克氏液，离体血管灌流槽，恒温灌流装置，微电极放大器，培养皿，哺乳动物手术器械， PowerLab 8S主机，微操纵器，冷光源，含95% O2+5% CO2混和气体等。
（三）实验基本过程
1．血管环制备
（1）大鼠麻醉后开胸剪除心脏，将肺组织向前翻开剪除，用有齿镊夹住主动脉上端并轻轻提起，在主动脉后方延胸壁向下剪开结缔组织，分离主动脉，剪除有齿镊夹持而损伤的部位。
（2）将主动脉放入含有Krebs-Henseleit缓冲液的平皿，Krebs-Henseleit缓冲液成份（mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl2 2.5，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25.0，glucose 11.0，Na2-EDTA 0.5。
（3）仔细分离剪除血管外脂肪组织与疏松血管外膜，然后将血管剪成2～3 mm长的血管环。
（4）用一不锈钢挂钩将血管环挑起并悬挂于张某某换能器上，调整挂钩血管环与另一固定挂钩的距离，然后将血管环穿入另一挂钩，调整血管环在两挂钩间的相对位置，挂钩位置固定后缓慢施加前负荷（静息张某某）至2 g（扣除挂钩重量）。
（5）将挂钩连同血管环浸入含有预平衡缓冲液（37℃）的血管槽，缓冲液持续通以95％氧气＋5％二氧化碳，使每一血管环在血管槽内的位置相对一致，平衡40～60min，期间每10～15min更换液体一次，待血管张某某稳定后可开始实验。
2．血管收缩舒张功能检测
（1）以60 mmol/L 氯化钾使血管环平滑肌去极化,反复重复此过程2次使血管环收缩达坪值；冲洗。
（2）重新平衡血管环，再用1(mol/L苯肾上腺素预收缩血管, 待张某某上升并稳定（通常1(mol/L苯肾上腺素加入后10～15min达平台）后, 加入1(mol/L乙酰胆碱舒张血管,以检测血管内皮的完整性（或称内皮依赖性血管舒张反应）。
（3）最大舒张反应大于80 %的血管环可被认为内皮完整,并用于内皮依赖性血管实验。
（4）去血管内膜的主动脉血管环制备：以直径与血管环相似的细绵签穿入血管腔内，在湿纱布上轻轻来回摩擦血管内腔3～5次，或以PE10或PE50管穿入血管腔内，将血管在湿纱布上轻轻滚动摩擦以去除血管内膜。用苯肾上腺素预收缩血管后在用乙酰胆碱检验血管舒张反应，如血管对乙酰胆碱无舒张反应或呈收缩反应，说明血管去除完全。
（四）观察项目
自行设计与确定影响主动脉血管的实验条件、观察项目，记录实验结果。
（五）讨论分析
1．对实验目的、设计原理进行阐释，实验结果进行总结与归纳。
2．对实验中不同药物使用后的各种观察指标变化进行分析，探讨其变化的发生机制。
3．如实验结果不理想，请分析其失败的原因和提出改进的措施。
（六）时间节点
1．完整、详细的实验设计方案必须在实验课的前一周完成。
2．实验操作时间控制在1天以内。
3．一周后以小组为单位用多媒体汇报实验结果和讨论分析。
（七）附录及注意事项
1．血管收缩与舒张工具药及其使用浓度：
（1）缓冲溶液的配制
1）Krebs-Henseleit缓冲溶液的配制：Krebs-Henseleit溶液为离体血管及离体心脏实验常用的一种缓冲溶液，按下述固定比例配制后pH值为7.4，具体配制试剂及用量（见表7-1）。
表7-1 Krebs-Henseleit’s Solution for Isolated Vessel Perfusion
Salt
Molecular weight
mmol/l
g/l
g/2l
g/5l
1
NaCl
58.44
118
6.90
13.8
34.5
2
KCl
74.55
4.7
0.35
0.7
1.75
3
MgSO4 anhydrous
120.36
1.2
0.14
0.28
0.7
4
NaHCO3
84.01
25
2.10
4.2
10.5
5
KH2PO4
136.09
1.2
0.16
0.32
0.82
6
Glucose.H2O
198.17
11
2.18
4.36
10.9
7
CaCl2 anhydrous
110.99
2.5
0.28
0.56
1.4
8
EDTA-Na2
372.24
0.5
0.19
0.38
0.95
2）高某某收缩溶液的配制：以氯化钾替代原Kreb－Henseleit中的部分氯化钾，制成等渗透压的缓冲溶液，用于刺激血管收缩，具体（见表7-2）。
表7-2 高某某60mM收缩液
Salt
Molecular weight
mmol/l
g/l
g/500ml
1
NaCl
58.44
62.6
3.66
1.83
2
KCl
74.55
60
4.47
2.235
3
MgSO4 anhydrous
120.36
1.2
0.14
0.07
4
NaHCO3
84.01
25
2.10
1.05
5
KH2PO4
136.09
1.2
0.16
0.08
6
Glucose.H2O
198.17
11
2.18
1.09
7
CaCl2 anhydrous
110.99
2.5
0.28
0.14
8
EDTA-Na2
372.24
0.5
0.19
0.095
（陈红）
四、家兔失血性休克的扩展性实验
（一）实验目的 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 脉处，于左侧肾上腺右上方找到横向行走的系膜上动脉，并分离出系膜上动脉（避免误伤静脉），用缝合针绕其穿一无创稍粗的缝合线备用。动物稳定15min后，结扎细线1h造成肠缺血（注意不要打死结），松开结扎线恢复其血流即再灌注。
3．按实验的自行设计方案完成动物实验操作步骤和指标观察。
（七）讨论分析
1．对实验目的、原理进行阐释，实验结果进行总结与归纳。
2．对实验中出现的各种观察指标变化进行分析，探讨其变化的发生机制。
3．如实验结果不理想，请分析其失败的原因和提出改进的措施。
（八）时间节点
1．完整、详细的实验设计方案必须在实验课的前一周完成，设计方案不合格者将取消实验资格。
2．实验操作时间必须控制在1天以内。
3．一周后以小组为单位用多媒体汇报实验结果和讨论分析。
（九）附录及注意事项
1．家兔正常生理指标(见第二章)。
2．移动内脏时，动作要轻柔，不要认为过度牵拉损伤肠管，脏器不要移出腹腔外并用纱布盖好。
3．实验过程不得危害人体健康和污染环境。
（李某某）
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