离子交换层析实验
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离子交换层析
实验目的
1、提纯上次实验得到的粗提液，去除球蛋白，以获得较高纯度的α1-AT蛋白
2、通过检测α1-AT对胰蛋白酶的抑制力来测定α1-AT的活力
3、双缩脲法测定α1-AT提取液中蛋白含量
实验原理
以离子交换剂为固定相，一定PH值和离子强度的溶液为流动相，利用待分离物质的电荷与离子交换剂的电荷之间的相互作用达到分离纯化的目的。
离子交换剂以不溶于水的惰性物质如纤维素，树脂，葡聚糖，琼脂糖等为支持物，通过化学反应（酯化、氧化和醚化等）共价连接带电基团。根据可交换离子的电荷性质，将离子交换剂分为阳离子交换剂与阴离子交换剂。
DEAE-纤维素 是应用最广的阴离子交换剂，呈弱碱性，本身带有正电荷，能不同程度的吸附溶液中的阴离子。
对于蛋白而言，结合力取决于其等电点以及溶液的pH值。样品以 pH6.4的PBS缓冲液溶解，DEAE-纤维素带有正电荷，可吸附带负电荷的蛋白质
使用不同离子强度 (0.05M、0.12M) PH6.4的PBS缓冲液进行分段洗脱，带负电荷少的球蛋白首先被洗脱，带负电荷多的α1-AT蛋白质后被洗脱
离子强度：
球蛋白㩳0.05M PBS 㩳 α1-AT 㩳 0.12M PBS
实验步骤
1、装柱
（1）连接层析柱，垂直固定。
（2）夹住出口，向柱内加入1/3高度的0.05M PBS（pH6.4）排走空气；将凝胶搅拌均匀，灌胶，待凝胶自然沉降约1cm时，打开出口，控制流速，30滴/分。继续添加凝胶，直至凝胶占层析柱达3-5 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 5
0.5
0.5
0.5
混匀，37℃?水浴5min
BAPNA
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
混匀，37℃?水浴10min
33%乙酸
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
/
2、410nm比色，记录数据
D对照=0.814 D血清=0.036 D G25=0.023 D DEAE=0.501
3、计算α1-AT活力
α1-AT活力（mg/ml）=D对-D检/D对×0.06 ×1/0.1
（D对 对照管光密度值，D检 检验管光密度值，0.06加入胰蛋白酶的量（mg））
血清α1-AT活力=0.576 G25α1-AT活力=0.584 DEAEα1-AT活力=0.236
蛋白定量，取4支试管加液如下。(单位：ml）
空白
血清
G25
DEAE
0.9%NaCl?
0.1
---
---
---
提取液
---
0.1
0.1
0.1
双缩脲
5.0
5.0
5.0
5.0
/
混匀，37℃ 水浴10min，520nm比色，记录。
D血清=0.276 DG25=0.169 D DEAE=0.092
3、计算蛋白含量
蛋白含量（mg/ml）=D待测/D血清×C血清 （C血清 =70 mg/ml）
血清蛋白含量=70 G25蛋白含量=43 DEAE蛋白含量=13.01
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