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现代生物学研究方法论

蛋白质的研究方法：金某某教授 （8学时）

表观遗传学研究方法：金某某教授（8学时）

免疫学研究方法：施某某教授（4学时）

人类疾病的动物模型：房某某教授 （8学时）

纳米技术在生物学研究中的应用：郭某某教授 （8学时）

蛋白质的研究方法

一、蛋白质的结构特征

1. 蛋白质的功能：1)细胞的积木;2)执行几乎所有细胞的功能;3)形成通道和泵;4)将信息从一个细传递到另一个细胞;5)做信号积分器;6)作为具有运动部件的微型分子机器:驱动蛋白、拓扑异构酶;7)抗体、毒素、激素、防冻分子、弹性纤维;8)发光源。

驱动蛋白：展现“行走”的力量。它能利用ATP水解所释放的能量驱动自身及所携带的货物分子沿微管运动的一类马达蛋白，与细胞内物质运输有关

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蛋白质中的三种非共价键

（1）分泌的或细胞表面的蛋白质经常在半胱氨酸残基的两个sh基团之间形成二硫键(如溶酶):;*二硫键不改变蛋白质的构象，但作为原子的主食，加强其最有利的构象。

（2）多肽链键角的位位限制

拉马钱德兰某某：通过x射线晶体学测定的高分辨率蛋白质结构有数万个，并保存在蛋白质数据库(PDB 160796蛋白)中。从1000个不同的蛋白质链中，绘制了超过20万个氨基酸的Ramachandran图，显示出一些显著的差异，特别是甘氨酸(Hovm?ller et al 2002)。

要点 1：1)大多数多肽链，只折叠成一种特定构象;2)大多数蛋白质可以自发折叠成正确的形状;3)蛋白质分子的形状是由其氨基酸序列决定的。

氨基酸序列决定了蛋白质的三维构象。

2常见的折叠模式在不同的蛋白质链中重复出现

虽然每个蛋白质的整体构象都是独特的，但在这些大分子的某些部分中，一些结构模式反复出现。

β-折叠：例如： fibroin（丝心蛋白）in silk（蚕丝）

Α-螺旋：(a-keratin （角蛋白）in skin, hair, nail);

3)线圈:两个相同的螺旋相互缠绕，形成特别稳定的结构。

3. 蛋白质是一种非常多才多艺的分子

胶原蛋白是动物结缔组织的主要蛋白质，也是哺乳动物中含量最丰富的蛋白质，约占全身蛋白质含量的25% - 35%。大量被称为胶原纤维的胶原蛋白束是细胞外基质的主要组成部分，它支撑着大多数组织，并从外部赋予细胞结构。

Elastin (弹力蛋白)在动脉中起重要作用，在大的弹性血管如主动脉中尤其丰富(大动脉）.弹性蛋白在肺部、弹性韧带韧带）皮肤、膀胱、弹性软骨

一、蛋白质有不同层次的结构组织

1. 蛋白质构象：形成蛋白质的每个原子在空间的特异排列；

（1）一级结构:氨基酸之间形成的所有共价键包括二硫键的位置，由形成蛋白质的氨基酸序列决定的。

（2）二级结构：多肽链中由相邻氨基酸残基间形成的有规律的、反复出现的空间排列；

（3）三级结构: 多肽链的完整三维结构，形成多肽链的所有氨基酸的空间分布；

（4）超螺旋结构： 多个多肽链组成的蛋白质中，各个亚基之间空间关系

2. Cap：分解代谢激活蛋白

Domain：蛋白质中具有特异结构与独立功能的区域，40-350 氨基酸组成。

要点II：1)只有很小一部分可能的蛋白质会采用稳定的三维构象;2)没有稳定构象的蛋白质将没有用处，被自然选择淘汰;3)具有极其稳定构象的蛋白质具有精确的化学性质，使其能够在细胞中执行特定的催化或结构功能;

要点III：新蛋白质通常是由旧蛋白质的改变进化而来的

1）一旦进化出一种具有功能的表面特性的蛋白质，它的基本结构可以插入到其他蛋白质中2）现存生物中具有不同但相关功能的蛋白质通常有相似的氨基酸序列

3) 这些蛋白质家族被认为是从单一的始祖基因进化而来的，并在进化过程中通过复制而产生新的基因，在此过程中逐渐积累突变而产生相关的具有新功能的蛋白质

4) 在其氨基酸序列中有超过25%相同氨基酸序列的两种蛋白质通常共享相同的整体结构。

5) 一个大蛋白质家族的不同成员通常具有不同的功能。

6) 通过基因组的序列分析，在任何有机体中的蛋白质家族都是很容易识别的。

1. 人类的染色体仅含有大约21,000个蛋白质编码基因。

2. 其中大约1000个基因编码免疫球蛋白结构域、500个蛋白激酶结构域，250个DNA结合同源域、300个SH3结构域和120个SH2结构域的DNA序列。

3. 并发现超过三分之二的蛋白质由两个或两个以上的结构域组成，并相同的结构域对在蛋白质中以相同的排列重复出现。

大多数蛋白质是相对较少的祖先类型的后代.

? 正如预期，许多大蛋白的序列经常显示，通过将已有的结构域以新的组合方式连接而进化，这个过程叫做域变换。

4.蛋白质分子常作为大结构组装的亚基

（1）超分子酶：复合体、核糖体、蛋白质丝、病毒和膜等结构是由许多预先形成的分子的非共价组装而成的。

优点:①用一个或几个重复的小亚基构建一个大结构可以减少所需的遗传信息数量②组装和拆卸都可以很容易地控制，因为子基通过相对低能量的多个键结合③由于修正机构可以在装配过程中运行，以排除畸形子单元，因此更容易避免结构合成中的误差。

蛋白质可以组装成片状、管状或球形

1)一些蛋白质亚基组装成平板，在平板上亚基以六角形排列。

2)封闭结构的形成，如环、管某某，提供了额外的稳定性，因为它增加了蛋白质亚基之间可以形成的键的数量。

3)在许多病毒中，相同的蛋白质亚基聚集在一起，形成一个球形外壳(衣某某)，包裹着病毒基因组，由RNA或DNA组成。

要点V：细胞中的许多结构都能自我组装

1)形成细胞中许多复杂大分子组合的信息必须包含在亚基本身中;2)烟草花叶病毒(TMV)是第一个被证明能够从其组成部分自我组装的大分子聚合体;3)并非所有的生物结构都是通过自组装形成的。

二、蛋白质的提取与样品制备

1. 样品制备原则

1）应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性；

2）防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰如酶性或化学性降解等；

3）完全去除样品中的核酸和某些干扰因素；

4）尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白质，从而保证待研究蛋白质的可检测性。

2. 样品制备原则

1、尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质的损失。

（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白质；

（2）不同类型的蛋白质需要不同的方法；

（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法；

2、细胞和组织样品的制备过程中，应尽可能减少蛋白质的降解，从特殊亚细胞器提取蛋白还需分级分离。

3、样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80°C，不要反复冻融样品；

4、通过超速离心清除所有的杂质，主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等

5、加入尿素之后，加温不要超过37°C，以防蛋白质氨甲酰化。

（一）细胞裂解的方法

1、温和裂解的方法：适用于组成比较简单的样品或分析特定的细胞器

（1）渗透裂解：通常用于血细胞、组织培养细胞等低渗溶液细胞；

（2）冻融裂解：液氮快速冻融，然后在37°C融化,反复几次,适合于细菌、组织培养细胞；

（3）去污剂裂解：溶解细胞膜释放内含蛋白质，主要针对组织培养细胞；

（4）酶裂解：在等渗溶液中用酶去细胞壁，常用的酶有溶菌酶(细菌)、纤维素酶 + 果胶酶(植物)、溶细胞酶（酵母）。

2、剧烈的细胞裂解方法

主要针对难破碎的细胞、酵母细胞和细胞亚组织

（1）超声裂解法：利用超声波产生的切应力破碎细胞，但要注意产生热量和气泡；

（2）研磨法:加液氮和沙进行研磨，适合于固体组织和微生物细胞；

（3）机械匀浆法：破碎固体软组织和动物组织（切成小片），同时要加入预冷的匀浆溶液；

（4）玻璃珠匀浆法：适用细胞悬液或微生物，目的在于破碎细胞，提取内含蛋白质。

3、蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解

防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、pH>9的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加酶抑制剂（以下一种或数种的混合物）

（1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度1mM，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。

（2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度4mM，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。

（3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为1mM，作用对象为金属蛋白酶。

4、蛋白质沉淀步骤

（1）硫酸铵盐析

原理：高盐将蛋白质沉淀出来，从而与核酸分离；

步骤：蛋白质浓度>1mg/ml，缓冲溶液浓度>50mM(含EDTA),缓慢加入(NH4)2SO4,搅拌10-30min，离心分离。

注意点：只用作预分离和富集，且(NH4)2SO4会干扰IEF

（2）TCA沉淀

三氯乙酸（终浓度10-20%）加到提取液中混均，置冰上30min，最后用丙酮或乙醇清洗沉淀除TCA。该法不易造成蛋白质变性和化学修饰。

3）丙酮沉淀

提取物加入3倍体积的冰丙酮，-20℃沉淀2小时，离心空气干燥去丙酮。

（4）丙酮/TCA沉淀

用丙酮在10%的TCA中重悬样品溶液（含有0.01的?-巯基乙醇或20mmol/L),-20℃沉淀45min,离心分离,丙酮清洗沉淀,空气干燥。

（5）苯酚提取

蛋白质提取到饱和酚中，加到甲醇溶液中NH4CA沉淀，然后先用NH4CA洗涤，再用丙酮洗涤，空气干燥去丙酮。本法适合于高杂质的植物样品。

5、清除影响二维电泳图谱的杂质

（1）盐、残留的缓冲液和电性小分子盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通

常用透析、凝胶过滤、沉淀/重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。

（2）内源性小分子

这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，可采用丙酮/TCA沉淀去除。

（3）离子去污剂

SDS等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰IEF，-200C的丙酮溶液可除去。

（4）核酸

核酸增加样品黏度，导致二维电泳背景发散；能与蛋白质结合，阻碍聚焦；银某某时出现高某某。加0.1V的核酸酶溶液(1mg/ml DNAase+0.25 1mg/ml RNAase+50mmolMgCl2)冰上孵育,但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。

（5）多糖

多糖能阻碍凝胶孔径、与蛋白质形成复合物，可用(NH4)2SO4或苯酚- NH4CA沉淀后离心，或用超速离心去多糖

（6）脂类

脂类易和膜蛋白结合成复合物，改变蛋白溶解性、等电点和分子量，采用大量去污剂可除去。

（7）酚类

通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质，可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。

6、裂解液的组成

目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全溶解和变性

组成：尿素+去污剂+（有时）还原剂

原理：（1）尿素能溶解和解折叠蛋白，最低作用浓度为8M，硫脲可增加膜蛋白质的溶解

（2）去污剂防止疏水相互作用蛋白质聚合，常用的去污剂有NP-40、Triton-X100，同时加4%CHAPS或0.25%SDS效果更好。

3）还原剂用于断裂二硫键，常用的有DTT（二硫苏某某）、TDF （二硫赤藓糖）和

TBP（三丁基膦）

使用注意点：

① 样品离心前在室温下至少保持1小时，

使完全变性和溶解；

② 样品含尿素不可加热，以防蛋白质修饰；

③ 样品类型不同，选择裂解液的组成也不同

三、蛋白质的分离与二维电泳技术

(一) 二维电泳的基本原理：

根据蛋白质的两个一级属性等电点和相对分子量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按等电点高低进行等电聚焦分离（IEF），在第二方向按照分子量大小进行SDS-PAGE分离（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）

1D-SDS-PAGE

（1）原理

在1D-SDS-PAGE中，蛋白质样品溶解在通常含有巯基还原剂（巯基乙醇或DDT)和SDS的上样缓冲液中。SDS与蛋白质结合，以与分子质量约恒定的比例将负电荷（来自SDS硫酸基团）传递给蛋白质。高电压下，蛋白质- SDS复合物在交联的聚丙烯酰胺凝胶上迁移，其速度取决于它们穿越凝胶孔基质的能力。蛋白质按照分子质量次序分离形成条带

（2） 1D-SDS-PAGE的局限性

用1D-SDS-PAGE得到的分离度是相当有限的，显示含有单一蛋白质的条带实际上可能含有多种蛋白质分子。

2D-SDS-PAGE

（1）两种分离方法的结合

①根据等电点用IEF分离蛋白质；

②在聚丙烯酰胺凝胶上电泳进一步分离聚焦的蛋白质。2D-SDS-PAGE在第一向电泳根据等电点的不同，第二向电泳根据分子质量的不同分离蛋白质。

（2）新式2D-SDS-PAGE

新系统使用固相PH梯度（IPG)胶条和相对简单的硬件，能很容易的从IPG胶条将蛋白质转移到SDS-PAGE平板凝胶中。在固相PH梯度中，聚羧酸两性电解质固定在支持物上，产生可重复的PH梯度。

2D凝胶分离蛋白质的染色

通过2D凝胶分离蛋白质的显色使用通常的染色技术，包括银某某、考马斯亮蓝和酰胺黑染色。银某某和新的荧光染料是最灵敏的。

2D-SDS-PAGE存在的问题

1）进行可完全重复的2D-SDS-PAGE分析是困难的。

2）某些蛋白质不适于进行第一维IEF步骤。许多较大的疏水蛋白质在这种类型的分析中结果不理想；由于蛋白质存在不同等电点的多种形式，蛋白质的IEF常把蛋白质分离成许多不连续的条带。

3）作为检测技术的蛋白质染色的动态范围相对较小。点密度最多能反映100倍的蛋白质浓度范围。

3. 二维电泳分辨能力

传统的二维电泳最好条件下20cm × 20cm的胶理论上可分辨10,000个蛋白点（各个方向100点）,实际上只能分辨3000个点、二维电泳可提供的数据二维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝某某、银某某、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的“满天星”，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质相对分子量、等电点和相对丰度三方面的数据。

4、二维电泳结果说明

二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白，由于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键还原和烷基化处理，即蛋白质的高级结构已被消除，最终得到的是蛋白质的亚基。

四、蛋白质的检测技术

（一）考马氏亮蓝某某色

考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类三苯基甲烷衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350 （红兰色） 、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰（ 595nm 最大），且在比较宽的范围内（15ng-20 mg ）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解某某。

（二）银某某

1、原理：二维凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后浸泡在银盐溶液中，蛋白与Ag+络合，凝胶空白背景中Ag+结合不牢而被冲洗，然后在酸碱环境中络合的Ag+被还原成金属银，蛋白点上金属银被曝光显示棕黄色或棕黑色。

2、特点

（1）银某某分酸性（ AgNO3）与碱性（Ag(NH3)2+）两种,酸性染色背景浅、容易控制，碱性灵敏度稍高，但背景深、不容易控制。

（2）相对于考染，灵敏度高，可达200pg。

（3）但由于存在戊二醛的特异性反应，对下一步的酶切肽谱提取存在困难,增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。

(三)负染

1、原理（锌-咪唑染料）

咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固，留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域，就是负染过程。

2、特点

（1）负染能提高SDS-PAGE胶上蛋白质的回收率，负染色结果在凝胶表面产生半透明背景，而凝胶显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。

（2）显色过程仅需5-15min

（3）蛋白质易从胶上取出，一般用EDTA络合金属离子

就可转移出蛋白质。

（4）灵敏度15ng。

（四）荧光染色

1、原理：利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光，通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块2-DE胶上进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。

2、特点

（1）灵敏度250pg与银某某相近，但线性范围高于银某某。

（2）蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能，

降低了溶解性，导致质谱鉴定出现偏差。

（3）不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能

基团数不一样，灵敏度变化不一样。

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表观遗传学研究方法论

一、表观遗传学

1. 表观遗传学：是指在基因(DNA)序列没有发生改变的情况下，染色质结构改变所引起的基因表达和功能发生了可遗传的变化。

表观遗传机制对基因转录调控至关重要：染色质重塑，组蛋白修饰，非编码dna，dna甲基化

2.基因的表达与调控：（1）基因表达通过转录及翻译产生蛋白质产物，或转录后直接

产生RNA产物的过程。

（2）基因表达调控：基因表达的开启或关闭以及基因活性的增加或减弱等，受表观遗传机制的调节和控制（时间和空间特异性）。

（3）基因表达调控的生物学意义：:适应环境、维持生长和增殖；维持个体发育与分化

3. 基因表达调控的多层次和复杂性：dna水平（基因激活）：如转录因子、转录辅助因子、染色质结构的改变、DNA甲基化-rna水平（转录起始：转录后加工mrna降解）：非编码RNA、RNA修饰、RNA编辑等-蛋白质水平（蛋白质翻译，翻译后加工修饰蛋白质降解等）：蛋白质稳定性、翻译后修饰、蛋白-蛋白相互作用等

4. 真核生物基因结构

（1）严格的“基因” 分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必须的全部核苷酸序列。

（2）启动子：是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、决定基因转录起始

与否的DNA序列（100~1000nt），本身无编译功能，但能调控基因表达

（3）基因转录调控序列：调控序列包含启动子、增强子、

（4）基因转录表达的调控

增强子及其功能：①增强子与辅助因子和转录因子（TFs）结合成DNA元件，能够通过染色质环来增加其靶基因的转录水平。

②增强子可能与其调节的启动子相距数千Kb，可以在上游或下游。二者远离时，基因处于失活状态，当二者间形成loop结构而靠近时，基因处于活性状态，并募集相应转录因子，促进基因表达。

二、基因表达的分析方法：（一）基因启动子分析：1.印迹杂交 2.RNA酶保护分析法

?EMSA

?Reporter gene assay

?DNA truncation & site-

directed mutagenesis

?In vitro reconstitution assay

?ChIP assay

（二）翻译后蛋白的分析

?Western blots

?Immunocytochemistry

?Immunohistochemistry

?Protein modification

?Proteomics

（三）转录组分析

?Differential screening

?Substractive hybridization

?Differential display

?Array-based methods

（四）转录分析

?Northern blots

?RNase protection assay

?Reverse transcription PCR

?R 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 来，实现目标基因的敲除。

⑦CRISPR/Cas9技术用于基因Knock out或Knock In

sgRNA靶序列设计在基因的外显子区，尽量靠近编码区上游;对于含有多个转录本的编码基因，靶序列应设计在同源区。Cas9切割基因组后，通过非同源末端连接(NHEJ)产生移码突变，达到基因敲除目的,也可以用含待敲入序列的donor质粒为模板，通过同源修复(HDR)方式，引入点突变或者外源基因

思考题：

、熟悉萤光素酶报告基因技术的原理及其应用；

2、熟悉CRISPR/Cas9系统的作用原理及其应用。

3、通过已学的实验技术能够设计实验。如要研究miR-372对靶

基因MAP3K2的转录后调控作用，该如何设计实验？

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