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ICS?01.040.11

C 62?

?????



团体标准

T/JPMA XXX—2019

细菌性腹泻中11种致病菌的快速检测

多重PCR方法

Multiplex PCR assay for the detection of 11 pathogenic bacteria in bacterial

diarrheal diseases







2019 - XX- XX发布

2019 - XX - XX实施

?????**_*???发布

前??言

本标准按照 GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由*_**提出。

本标准由**_*归口。

本标准起草单位：*_**、*_**、**_*。

本标准主要起草人：丁某某、张平、朱某某、杜某某、唐某某、曾滨、谢某某、江某某、叶某某、石某某、王燕、白某某、王炜。细菌性腹泻中11种致病菌的快速检测 多重PCR方法

范围

本标准规定了O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、沙门菌、志贺菌、致病性小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、致泻大肠埃希氏菌的5种类型（EPEC、ETEC、EIEC、O157：H7血清型EHEC和EAEC）共11种致病菌的多重PCR检测方法。

本标准适用于粪便样本中O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、沙门菌、志贺菌、致病性小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血弧菌、致泻大肠埃希氏菌的5种类型（EPEC、ETEC、EIEC、O157：H7血清型EHEC和EAEC）共11种致病菌的快速检验。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB 19489 实验室生物安全通用要求

缩略语

下列缩略语适用于本文件。

EPEC 肠道致病性大肠埃希氏菌 (Enteropathogenic Escherichia coli)

EIEC 肠道侵袭性大肠埃希氏菌 (Enteroinvasive Escherichia coli)

ETEC 产肠毒素大肠埃希氏菌 (Enterotoxigenic Escherichia coli)

EHEC 肠道出血性大肠埃希氏菌 (Enterohemorrhagic Escherichia coli)

EAEC 肠道集聚性大肠埃希氏菌 (Enteroaggregative Escherichia coli)

eae 紧密素基因 (gene encoding intimin for Escherichia coli attaching and effacing)

elt 热不稳定性肠毒素基因 (heat-labile enterotoxin)

est 热稳定性肠毒素基因 (heat-stable enterotoxin)

ipaH 侵袭性质粒抗原H 基因 (invasive plasmid antigen H-gene)

rfb O抗原合成基因簇

aggR 集聚黏附菌毛调节基因 (aggregative adhesive fimbriae regulator)

virA 毒力调控基因

hlyA 溶血素基因 (hemolysin A)

ctxB 霍乱毒素B亚单位基因 (Cholera?toxin?B?subunit)

invA 侵袭蛋白A基因 (invasion?protein A)

tlh 不耐热溶血毒素 (Thermolabile hemolysin)

toxR 跨膜调控蛋白R基因 (transmembrane?regulatory protein R)

ail 粘附侵袭位点基因 (attachment invasion locus)

malK 麦芽糖ABC转运子ATP结合亚单位 (maltose ABC transporter ATP binding subunit)

DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）

原理

在PCR反应体系中加入针对每种靶基因的一对低浓度的特异性嵌合引物（5’端连接一对通用序列），同时加入一对高浓度的通用引物，该通用引物的序列与嵌合引物上的通用序列完全一致。根据引物特征，扩增过程采用3个不同的退火温度。用毛细管电泳仪进行检测，根据PCR产物片段长度判定该样品中是否含有目的致病菌核酸成分。

主要设备和材料

主要设备

PCR仪。

毛细管电泳仪。

高速台式离心机（离心转速12000 r/min 以上）。

台式离心机（离心转速2000 r/min）。

II级生物安全柜。

冰箱（-20℃）。

涡旋振荡器。

水浴锅。

微量可调移液器（0.1 μL～2 μL、1 μL～10 μL、10 μL～100 μL、100 μL～1000 μL）。

材料

灭菌离心管（1.5 mL、2 mL）。

灭菌吸头（10 μL、200 μL、1 mL）。

灭菌PCR扩增反应管。

研磨珠。

试剂

一般要求：除特殊说明外，试验用水为符合GB/T 6682的灭菌双蒸水或超纯水，所用化学试剂均为分析纯。

DNA抽提试剂：粪便基因组DNA提取试剂盒TIANamp Stool DNA Kit（含缓冲液SA，缓冲液SC，缓冲液SH，缓冲液GFA，缓冲液GD，漂洗液PW，洗脱液TB，RNase A 10 mg/ml，吸附柱CR2），或其他等效产品。

无水乙醇。

异丙醇。

PCR试剂：QIAGEN Multiplex PCR Kit或其他等效产品。

毛细管电泳预制胶：QIAxcel High Resolution Kit预制胶卡夹及缓冲液，或其他等效产品。

毛细管电泳DNA分子量标准：DNA Alignment Marker（15bp/1kb）， DNA Size Marker (50 bp～800bp) 或其他等效产品。

引物：根据表1和表2序列合成引物。引物加无DNase、无RNase灭菌双蒸水或超纯水配制成10×储存液（通用引物5 μmol/L，每种靶标嵌合引物 0.5 μmol/L），-20℃保存。

表1 A组多重PCR嵌合引物

致病菌

靶基因

嵌合引物序列

扩增片段长度













霍乱弧菌

hlyA

5’-AGGTGACACTATAGAATAGAAGACAACGCATTACCGA-3’

5’-GTACGACTCACTATAGGGAACTGGCTCCAAACTGACGA-3’

643





ctxB

5’-AGGTGACACTATAGAATAAAGCAGTCAGGTGGTCTTATG-3’

5’-GTACGACTCACTATAGGGATGATGAATCCACGGCTCTT-3’

534



O1群霍乱弧菌

rfbN

5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGAGGGTGGTATGGTTGT-3’

5’-GTACGACTCACTATAGGGACTTTTCTGCCAAATGCTCGT-3’

459



O139群霍乱弧菌

rfbN

5’-AGGTGAC 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 e阳性或阴性；malK阳性。



EAEC

aggR，malK

aggR和malK阳性。



 a 部分志贺菌株malK阳性，与EIEC难以区分，需用生化试验进一步鉴定。



序列测定

必要时，可取待测样本扩增出的PCR产物进行序列测定，序列结果与公开发表的相应靶标片段进行比对，序列同源性在90%以上，可确认待测样本中相应的靶基因核酸片段阳性，否则判为阴性。

（资料性附录）多重PCR 扩增实例参照

A组9个靶标基因多重PCR扩增阳性的毛细管电泳图

B组7个靶标基因多重PCR扩增阳性的毛细管电泳图

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