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学 生 实 习 报 告

实 习 名 称： 生物分离工程

实 习 时 间： 2020 - 2021学年 第 1 学期

专 业 班 级 ： 生物工程1801

姓名（学号）： 姜某某（***219）

2021年 9 月 21 日

一、目的要求

理解离子交换层析技术、薄层色谱及等电点沉降的原理及主要影响因素，掌握离子交换在生物分子分离中的操作方式以及树脂的平衡、洗脱、再生及吸附容量测定等技能；掌握薄层色谱在氨基酸定性分析中的应用；掌握等电点沉降在蛋白质分离纯化中的应用。培养学生正确观察、缜密思考以及诚实记录的学习态度、方法和习惯；培养学生严谨的科学作风，增强学生分析问题和解决问题的能力。

二、基本原理

本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）从苯丙氨酸（Phe，pI=5.48）和赖氨酸（Lys，pI=9.74）混合液中将二种氨基酸分离出来。在pH3.0时，因为低于Lys和Phe的pI值，两种氨基酸均带正电荷挂在树脂上；在pH7.0时，Phe带负电荷而从柱中流出，Lys带正电荷，仍停留树脂上，并可通过NaCl将其洗脱下来。这样通过改变洗脱液的pH值即可将二种氨基酸分离，并利用薄层色谱进行定性分析。

三、实验材料

1．离子交换树脂和酶

732型强酸性阳离子交换树脂；花生蛋白粉；食品级α-淀粉酶。

2．实验器材

玻璃层析柱：长20cm，内径1cm；止水夹；分光光度计；水浴锅；试管；层析缸；层析滤纸；烧杯；铁架台；G型薄层硅胶板；蠕动泵；烘箱；玻璃棒；滤纸；酸式滴定管；分光光度计，石英比色皿；一次性塑料滴管；铁架台；烘箱；电吹风；毛细管；喷雾器；尺子；铅笔。

3．试剂

苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、NaOH、HCl、酚酞指标剂、茚三酮、乙醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、NaCl、正丁醇、冰醋酸、Fe2(SO4)3、CuSO4、可溶性淀粉、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、考马斯亮蓝G250、牛血清白蛋白、85%浓磷酸、95%乙醇。。

四、实验步骤与方法

1、溶液配制（Day 1）

1mol/L HCl 1L；0.1mol/L HCl 2L；pH3.0 HCl溶液 2L；

1mol/L NaOH 1L；0.1mol/L NaOH 2L； 0.01 mmol/L NaOH溶液 1L（pH12.0）；

pH3.0 2g/L Phe溶液 1L（OD280≈0.070）；pH5.5 2g/L Phe溶液 1L；pH9.0 2g/L Phe溶液 1L；0.05mol/L Phe和0.01mol/L Lys溶液各100mL；Phe和Lys的混合溶液，浓度各为0.01mol/L，溶于pH3.0的HCl溶液中；

5g/L Fe2(SO4)3-CuSO4混合溶液 1L；1%葡萄糖 100mL；

pH7.0水溶液 1L；茚三酮试剂 500mL；60%乙醇 1L；展开剂：正丁醇:冰醋酸:水=4:1:1 1L；0.2%茚三酮正丁醇溶液 250mL；

1%可溶性淀粉 500mL；0.1mol/L pH5.6柠檬酸缓冲液500mL；0.2mol/L pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液500mL；

3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂：精确称取1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20mL 1mol/L NaOH中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL）1L；

G250配制：精确称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50mL 90%乙醇中，并加入100mL 85%浓磷酸，然后用蒸馏水定容至1000mL。

牛血清白蛋白（BSA）溶液配制：精确称取0.060g BSA，加入0.526g NaCl，溶于水量蒸馏水中，然后稀释定容至500mL，配成120μg/mL的BSA原某某。

α-淀粉酶溶液：取α-淀粉酶粉一瓶（250g），加入600mL蒸馏水充分搅拌、冰箱中静置过夜，用滤纸过滤（过滤两次）后定容至500mL或1L（每组50mL，根据分组数量确定）。本实验开始前一天准备，现配现用。

2、离子交换树脂的预处理（Day 1）

工业产品的树脂常含有一些过剩溶剂、低聚物和其它杂质，必须除去否则将影响交换效果，因此新树脂必须进行预处理。根据条件不同，可得到H型或Na型的树脂。为了避免在分离纯化时溶液pH值变化过于剧烈，本实习在分离时采用Na型树脂，但是在测定离子交换容量时采用H型。

清洗：100mL烧杯中放入约50g树脂，用50mL 1mol/L盐酸浸泡过夜。第2天倾去清液，再用盐酸反应洗涤后用水洗至中性。再用1mol/L的NaOH处理，做法同上。最后用蒸馏水反复冲洗，直至洗水pH达到6.0左右。清洗完成。（注意：树脂必须洗涤干净，以充分除去色素，避免对比色造成影响）

H型树脂：将清洗得到的树脂用50mL 1mol/L盐酸再浸泡1h后，倾去清液，洗至中性即得H型树脂。在测定离子交换树脂交换容量及吸附分离金属离子时需使用H型树脂。（约需10g）

Na型树脂：将H型树脂再用1mol/L的NaOH浸泡1h后，倾去清液，用蒸馏水洗至中性即得Na型树脂。在后续交换容量影响因素的测定及氨基酸的分离中将使用该树脂。（约需40g）

3、离子交换树脂交换容量的测定（Day 2）

离子交换容量指单位重量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的物质的量，是表征离子交换能力的主要参数之一。

对于阳离子交换树脂，先用盐酸将其处理成氢型后用滤纸吸干水份。称取3.00g湿树脂放入250mL三角瓶中，准确加入50mL 0.1mol/L的NaOH溶液，摇匀，将锥瓶盖紧后放置1h，吸取上层清液15.00mL于三角锥瓶中，加入2滴酚酞，用0.l mol/L的HCl标准溶液滴定至红色刚好褪去，即为终点。记下消耗的标准HCl溶液体积，平行滴定二份，使用过的树脂回收在烧杯中，统一进行再生处理。按下式计算树脂的交换容量Q：

4．离子交换树脂对氨基酸吸附容量的测定及影响吸附的因素（Day 2）

离子交换树脂的交换容量是指每克干燥树脂或每毫升溶胀后的树脂所能交换的物质的量（mmol），用mmol/g（干树脂）或 mmol/mL（湿树脂）表示。树脂的交换容量受诸多因素的影响，有静态吸附容量和动态吸附容量之分。本实习以Phe（在280nm下有光吸收，检测方便）为例，研究NaCl浓度和pH值对阳离子交换树脂吸附容量的影响。

4.1试剂

处理好的Na型强酸性阳离子交换树脂、2g/L Phe溶液、NaCl

4.2仪器设备

分光光度计、磁力搅拌器.

4.3测定步骤

pH值对吸附容量的影响：Phe的等电点为5.48。取20mL的pH3.0、pH5.5和pH9.0的2g/L的Phe溶液分别放于100mL烧杯中，加入5g处理好的Na型强酸性阳离子交换树脂，在搅拌条件下交换20min后在280nm下比色，测定溶液中Phe的含量，计算吸附容量。

NaCl浓度对吸附容量的影响：在上述确定的吸附容量最大的pH值下，称取NaCl粉末于Phe溶液中，使NaCl浓度分别达到0、0.05mol/L、0.1mol/L和1mol/L，按上述相同的条件反应和测定Phe的含量，计算吸附容量。

Phe浓度的测定：Phe在280nm下有光吸附，因此可配制系统标准溶液绘制标准曲线，根据标准曲线来计算样品溶液中色氨酸的含量。

计算吸附容量，分析pH值和离子强度对树脂吸附容量的影响。

5、离子交换树脂分离金属离子（Day3）

阳离子交换树脂可用于金属离子的吸附，三价离子的吸附能力通常要强于二价离子。金属吸附之后，可采用不同浓度的NaCl溶液将具有不同吸附能力的金属离子洗脱下来。本实习以Fe2(SO4)3和CuSO4为例来了解离子交换树脂在金属离子吸附中的应用及通过改变离子强度进行洗脱的操作。

5.1试剂

H型强酸性阳离子交换树脂、5g/L的Fe2(SO4)3-CuSO4混合溶液、NaCl。

5.2测定步骤

将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高的蒸馏水。将预处理好的H型树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的蒸馏水，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到6cm左右高度为止。在装柱时要避免柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定。装好的柱体应该没有纹路、没有裂痕、没有气泡和柱顶表面平整而均匀。

将Fe2(SO4)3-CuSO4溶液连续缓慢滴加到树脂中，进行如下观察和操作：

观察树脂颜色的变化（是否变色、什么颜色、颜色分布是否均匀）；

用pH试纸测定流出液pH值的变化；

观察出口流出液颜色的变化（是否有颜色以及何种颜色）；当观察到有颜色出现时，根据颜色判断是何种金属离子流出，同时关注柱内树脂色带的变化；

当出口液有颜色出现时，继续添加少量的金属离子混合溶液，继续观察出口液及树脂颜色的变化；

停止添加金属离子混合溶液，用蒸馏水冲洗柱子，观察洗脱液及树脂是否有颜色变化；

用不同浓度的NaCl洗脱柱子（NaCl浓度由低到高，从0.01mol/L开始），观察柱子出口处溶液颜色及颜色深浅的变化。

用高浓度的NaCl冲洗柱子，将吸附的金属离子全部洗出。

6．离子交换色谱分离氨基酸混合物（Day 4）

采用静态吸附的方法分离Phe和Lys的混合物。取5mL浓度为2g/L、pH值为3.0的氨基酸混合液于三角瓶中，加入20g的Na型强酸性阳离子交换树脂，混合均匀，震荡10min，吸取少量溶液记为样品1；测定及调节剩余混合液pH值，使之在7.0左右（注意：调节pH值时尽量使用高浓度的NaOH，以避免样品过度稀释而导致无法检出）。震荡10min，取出离子交换树脂，剩下的溶液保留待测，记为样品2；将取出的离子交换树脂用蒸馏水充分冲洗后，置于10mL 1mol/L的NaCl溶液中震荡10min，所得溶液记为样品3（注意：NaCl溶液不宜过多，否则会导致氨基酸含量过低而无法检出）。两种氨基酸的混合溶液记为样品4，两种氨基酸的标准溶液分别记为样品5和样品6。

7．氨基酸的定性分析（Day 4）

采用薄层色谱法对所得样品的氨基酸种类进行定性分析。

7.1．试剂

扩展剂：正丁醇:冰醋酸:水=4:1:1，充分振荡。

显色剂：0.2%茚三酮正丁醇溶液。

0.1mol/L的氨基酸标准品：准确称取各种氨基酸溶解于蒸馏水中。

7.2．仪器设备

层析缸；毛细管；喷雾器；硅胶层析板。

7.3．实验步骤

点样：用毛细管将1~6号样品在距薄板一端1.5cm处、间距1cm分别点样，用电吹风吹干样点。

展开：先在层析缸中放入展开剂，将层析板有样品一端接触展开剂，使其展开，但不可使样点浸没于展开剂中。在板的另一端的背面垫上一小青霉素瓶，使薄板呈约30°倾斜，密闭层析缸。待展开剂前沿距离板的末端约1cm处时，将板取出用电吹风吹干薄层。

显色：向薄板喷撒茚三酮显色剂，将薄板置于100℃烘箱烘烤约10min，会观察到有紫色斑点出现。

定性：分别测量溶剂前沿至原点中心的距离，以及各色斑中心至原点中心的距离，计算各标准氨基酸及各样品斑点的Rf值，鉴定各样品液中氨基酸的种类。

8．花生分离蛋白的提取（Day 5）

称取2g花生蛋白粉，分散于50mL蒸馏水中，用1mol/L NaOH调节pH值至9.0，于50℃下浸提时间120min，过滤除去不溶性物质，用1mol/L盐酸溶液调节滤液pH值，观察沉淀的出现，估算出花生分离蛋白的等电点，过滤或离心收集沉淀即得花生分离蛋白，80℃下烘干后称重，计算花生分离蛋白的收率。

9．等电点沉降法分离淀粉酶（Day 6）

9.1．试剂

食品级α-淀粉酶、1%可溶性淀粉、1mol/L NaOH溶液、3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂：精确称取1g 3,5-二硝基水杨酸溶于20mL 1mol/L NaOH中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL）、0.2mol/L pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液

9.2．仪器设备

天平、分光光度计、水浴锅、烧杯、

9.3．实验步骤

将α-淀粉酶适当稀释后用0.1mol/L HCl溶液缓慢调节pH值，待有沉淀出现时静置一段时间后收集，记录此时的pH值，离心收集沉淀。将在不同pH值下收集得到的沉淀物分别溶解在一定体积的pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，测定酶活力和蛋白质含量；同时测定上清液中剩余的蛋白质含量和酶活力，计算酶活回收率和分离纯化倍数。

9.4．淀粉酶酶活力的测定

标准曲线绘制：分别吸取1.0%葡萄糖标准溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL于50mL容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升含200μg、400μg、600μg、800μg、1000μg、1200μg的标准溶液，按下表的操作步骤一起反应。以葡萄糖含量为纵坐标，以吸光度值为横坐标，绘制标准曲线。

样品测定：将样品经一定稀释后按下表操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致。

反应顺序

样品，标准

样品空白

标准空白



样品稀释液/mL

0.5

–

–



蒸馏水/mL

–

0.5

0.5



50℃预热5min

√

√

√



依次加入淀粉溶液/mL

1.5

1.5

1.5



混合

√

√

√



50℃保温30min

√

√

√



依次加入DNS试剂/mL

3.0

3.0

3.0



混合

√

√

√



100℃煮沸7min

√

√

√



冷却

√

√

√



蒸馏水/mL

10

10

10



混合均匀

√

√

√



总体积

15

15

15





比色：反应后的样品在室温下静置10min，如出现混浊需要在离心机上以4000r/min离心10min，上清液以标准空白调零，在在分光光度计540nm处测定样品空白（A0）和样品溶液的吸光度值。注意，吸光值切不可超过0.9，否则必须将样品适当稀释；如需稀释，请按10倍数稀释。

活性计算：酶活力定义单位为60℃、pH6.0条件下每小时从1%可溶性淀粉中释放出1μmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位，按下式计算：

式中：U为淀粉酶活性（U/mL）；k为标准曲线斜率；F为样品溶液反应前的总量（mL）；S为样品测试量，本处为0.5mL；180为葡萄糖的相对分子质量。

9.5．蛋白质含量的测定

G250配制：精确称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50mL 90%乙醇中，并加入100mL 85%浓磷酸，然后用蒸馏水定容至1000mL。

牛血清白蛋白（BSA）溶液配制：精确称取0.060g BSA，加入0.526g NaCl，溶于水量蒸馏水中，然后稀释定容至500mL，配成120μg/mL的BSA原某某。

标准曲线绘制：取5支试管，分别精确吸取BSA原某某0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，用蒸馏水补足1mL，然后分别加入5.0mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，于25℃水浴中保湿10min，冷水浴中冷却后，立即于595nm处比色，以1.00mL蒸馏水代替样品液，加入5.00mL考马斯亮蓝溶液，其它操作同上，做空白对照。绘制标准曲线。

样品测定：将沉淀适当稀释（使其测定值在标准曲线的线性范围内），取1.00mL稀释液于试管中，按上述相同的方法加入考马斯亮蓝溶液比色测定，根据标准曲线计算线性方程，计算出未知样品的蛋白质含量。注意，吸光值切不可超过0.9，否则必须将样品适当稀释；如需稀释，请按10倍数稀释

9.6．酶活回收率和分离纯化倍数的计算

酶活回收率：分别测定原酶液和沉淀中淀粉酶的总活力，两者相除即得。

分离纯化倍数：分别测定原酶液和沉淀中淀粉酶的总活力和总蛋白质含量，计算原酶液和沉淀中的比酶活，两者相除即得分离纯化倍数。

10. 实习总结（Day 6）

五、实验结果

1、溶液配制，小组分工合作

2、离子交换树脂预处理

3、离子交换树脂交换容量

4、VHCL滴定：4.75ml、5.25ml、 平均值为5.00ml、CHCL=0.1mol/L

由公式得Q=1000×0.1×(15.00-5.00)×50/3.00/15=1110mmol/g

Phe原某某

PH3.0

PH5.5

PH9.0



原某某吸光值

0.052

0.051

0.051



吸附后吸光值

0.028

0.032

0.033



原某某吸光值/吸附后吸光值=2g/L/x



浓度g/L

0.929

0.797

0.773



吸附容量g/g

0.0037

0.0031

0.0031



 附：吸附后吸光值：用各自PH下的未含Phe的同上述操作用Na型强酸性阳离子交换树脂处理的溶液标零。

280nm下比色

测得PH=3时，吸附容量最大。在PH=3溶液中加入不同浓度Nacl，

280nm下比色

C(Nacl)

0

0.05

0.1

1



吸光值

0

-0.010

0.002

0.019



原某某吸光值/吸附后吸光值=2g/L/x



浓度g/L

0









吸附容量g/g

0









附：吸附后吸光值：用各自C(Nacl)下在PH=3的Phe的同上述操作用Na型强酸性阳离子交换树脂处理的溶液标零。

实验结果测算不准确，实验失败。根据理论知识，离子交换吸附是基于静电相互作用，C(Nacl)能够破坏静电相互作用，所以C(Nacl)越高，数值吸附量越小，吸光值应该相较于C(Nacl)小的要高。

离子交换树脂分离金属离子

（1）、树脂变色，为上红下绿，颜色不均匀（2）、流出液pH由中性变为酸性（3）、流出口颜色从无色到蓝色再到混合溶液的颜色（4）、树脂绿色带下移，红色带加长，流出口由无色变为绿色（5）、树脂色带更加明显（6）、出口颜色由浅到深

离子交换色谱分离氨基酸混合物

样品一：PH=3，PH

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