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天然产物提取

序言

1.天然产物

是自然界各种生物体（植物、动物、微生物）中天然存在的具有生物活性的各种有机化合物。包括生物大分子物质和小分子有机化合物，如糖类、蛋白质类、核酸类、脂类、色素类、黄某某、生物碱类等。

2天然产物的分离纯化

在保持愈分离物质（目的物）原来的结构和功能的前提下，从含有多种物质的液相或固相中，较高纯度地分离出来。

3天然产物的研究目的

获取安全、无毒、高效的天然有效成分（天然药物、天然食品添加剂、生态农药等）服务于人类。

4天然产物的主要特点

资源丰富，种类多，分布广。结构复杂，含量低，用途广泛。是具有生物活性的有机化合物。（生理、药理）来源于生物体，毒副作用小，效果确切。是寻找新的、高效药物的重要途径。

分离纯化方法

（一）沉析

填空

★1、分离纯化依据：分子形状和大小、电离性差异、极性大小及溶解度不同、物质吸附性质不同、配体特异性。

★2、分离纯化方法的评价标准：目标蛋白的纯化倍数和回收率。提高分离效率，减少分离过程步骤，缩短分离操作时间，达到提高产品收率与活性、降低生产成本的目的

3.原料的选择

选择有效成分含量高的材料；来源丰富易得；工艺简单易行；成本低，效益好

3、原料的粉碎方法：

机械破碎法：高压匀浆、珠磨破碎、撞击破碎、超声破碎

细胞破碎法 化学破碎法：化学试剂处理、酶溶

物理破碎法：渗透压冲击法、冻结-融化法

4、提取方法：浸提、回流提取、水蒸气蒸馏、超声波提取、微波提取、超临界流体提取。

紫杉醇的提取：回流提取、微波提取。

影响提取的因素

1.溶剂：对目的物具有最大溶解度2.温度3.pH：避免在目的物的等电点附近4.盐浓度：保护及助溶作用5.物料比、提取时间、提取次数

5、活性物质的保护措施：

①采用缓冲系统；

②添加保护剂；

③抑制水解酶作用；

④其他保护措施：避免紫外光、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频震荡、防止氧化。

6、提取液的分离方法：

①自然沉降：处理量大，相对密度悬殊；

②过滤：多孔材料截留固体；

③离心：液-固，液-液，离心过滤、离心分离、离心沉降。

沉析：利用沉析剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。

特点：①具有浓缩和分离的双重作用。

　　　　② 操作简单、经济、浓缩倍数高。

　　　　③应用广泛。

缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强，是一种初级分离技术。

★7、沉析种类：

盐析沉淀

有机溶剂沉淀

等电点沉淀

水溶性非离子型聚合物沉淀剂：PEG（聚乙二醇）

成某某类复合物沉析剂

沉析法 离子型表面活性剂

其他 离子型多聚物沉析剂

沉淀法 氨基酸类沉析剂

分离核酸用沉析剂

分离粘多糖用沉析剂

选择性变性沉析法

★8、脱盐的方法：透析、凝胶层析、超滤。

透析：利用常压下蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它水分子物质如无机盐、单糖等分开。

超滤：利用压力、抽滤或离心力等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。

凝胶层析：利用凝胶粒子为固定相，根据凝胶粒子的分子筛效应对样品中相对分子质量不同的物质进行分离的液相层析法。

★9、分离核酸用的沉析剂：酚、氯仿、十二烷基磺酸钠（SDS）等。

目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。

★10、用于沉淀酸性多糖的沉析剂：十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（CTAB）：主要用于沉淀酸性多糖。

判断

★1、盐析现象的原理：中和电荷、破坏水膜。

★2、影响盐析、有机溶剂沉析的主要因素

影响盐析因素：

①离子强度： lgS=β-KsI，离子强度大，蛋白质溶解度S小；

②溶质性质的影响：Ks和β值；

③溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；

蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；

④操作方式：间歇方式比直接方式盐量少；饱和溶液比固体盐用盐量高；

⑤pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近；

⑥温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降。

影响有机溶剂沉析因素：

①温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度降低）；搅拌散热；

②pH：pI附近；

③离子强度：离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L；（与盐析相反）

④样品浓度： 0.5~2%。稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小；

浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低；

⑤金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+。

有机溶剂沉析的特点

优点：①有机溶剂易挥发除去， 不残留，产品更纯净；

②沉淀物与母液间密度差较大，易某某，适用于离心分离。

缺点：①易使蛋白质变性，需在低温下操作；

②成本较高。

3注意事项

★3、蛋白质溶液等电点不是固定不变的：由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳—高，阴—低。

pH的调节

注意由于强酸、强碱引起局部过酸或过碱，会导致变性。酸、碱应同原溶液里的盐相适应（不增加新物质

简某某、计算

★★1、盐析原理

（1）首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态：

①两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系。

②蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞。

（2）当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：

①“盐溶”现象——低盐浓度下，随着中性盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大。②“盐析”现象——高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：

A.中和电荷——无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢。

B.破坏水膜——中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。

盐析用盐的几点考虑

盐析作用要强；需有较大的溶解度，温度影响小；必须是惰性的，不影响生物活性；来源丰富、经济

★★2、有机溶剂沉淀原理：

①降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。

介电常数与静电引力的关系：F=q1q2/εr2

②由于有机溶剂的水合作用，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。

★★3、等电点沉淀原理：

蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，分子间排斥电位降低，吸引力增大，相互聚集，发生沉淀。

★★4、解释向蛋白质溶液中加入中性盐溶液时出现的两种现象（盐析原理）

①“盐溶”现象——低盐浓度下，随着中性盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大。②“盐析”现象——高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：

A.中和电荷——无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢。

B.破坏水膜——中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。

★5、休克尔经验式

Cohn经验公式：logS=β?

K

??

I

式中：S—蛋白质溶解度，g/L β，Ks—常数

I—离子强度 c—离子浓度 Z—离子化合价

I=

1

2

??

??

??

??

2

★★6、Ks、β的物理意义，区分Ks盐析、β盐析的不同

物理意义：

β——当盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。为纵轴延伸的截距，与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；

Ks——盐析常数，为直线的斜率，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。

区别：

Ks盐析：在一定pH和温度下改变体系离子强度进行盐析的方法。

β盐析法：在一定离子强度下改变pH和温度进行盐析。

Ks盐析：由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，分辨率不高，因此常用于前期处理。

β盐析：由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于结晶。

★★★7、饱和硫酸铵（盐析剂）、有机溶剂体积计算公式

饱和度：饱和溶液体积占混合后溶液总体积的百分数。

以硫酸铵为例：25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度。

饱和硫酸铵溶液体积计算：

一次盐析：X=

????

1???

； 二次盐析：X=

??(

??

2

?

??

1

)

1?

??

2

；

式中：X：所需饱和溶液体积 V：蛋白质溶液体积

S1：已有一定饱和度的盐 S2：需增至饱和度的盐

有机溶剂体积计算公式：

X=

??(

??

2

?

??

1

)

1?

??

2

；

式中：V：原溶液体积 W1：原溶液中有机溶剂的质量分数（20%，W1=20）

W2：需要的有机溶剂质量分数 100：使用的有机溶剂是100%（也可为95，95%）

·水溶性非离子型聚合物沉淀剂：PEG（聚乙二醇）

·成某某类复合物沉析剂：高价金属盐，苦味酸盐，无机复合盐，容易使蛋白不可逆变性

·离子型表面活性剂:十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（CTAB）主要用于沉淀酸性多糖

十二烷基磺酸钠（SDS）主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白

·离子型多聚物沉析剂:温和的沉析剂，与目标蛋白成某某。核酸（多聚阴离子），用于碱性蛋白的沉淀；鱼精蛋白（多聚阳离子），用于酸性蛋白的沉淀

·氨基酸类沉析剂

·分离核酸用沉析剂：酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中

·分离粘多糖用沉析剂：CTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物)与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出

·选择性变性沉析法：利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。加入变性剂；选择性热变性；选择性酸碱变性，谨慎使用

结晶

概念：溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而呈晶态从溶液中析出的过程

结晶操作的特点

·只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。

·通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。

·结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。

3.晶核的概念

晶核：最先析出的微小颗粒是以后结晶的中心。

实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成—溶解—再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在

4.晶核的成核速度

定义：单位时间内在单位体积溶液中生成新核的数目。是决结.定晶产品粒度分布的首要动力学因素。·成核速度大，导致细小晶体生成。因此，需要避免过量晶核的产生

5.常用的工业起晶方法

·自然起晶法：溶剂蒸发进入不稳定区形成晶核，当产生一定量的晶核后，加入稀溶液使溶液浓度降至亚稳定区，新的晶核不再产生，溶质在晶核表面生长。

·刺激起晶法：将溶液蒸发至亚稳定区后，冷却，进入不稳定区，形成一定量的晶核，此时溶液的浓度会有所降低，进入并稳定在亚稳定区使晶体生长。

·晶种起晶法：将溶液蒸发后冷却至亚稳定区的较低浓度，加入一定量和一定大小的晶种，使溶质在晶种表面生长。该方法容易控制、所得晶体形状大小均较理想，是一种常用的工业起晶方法

6.晶体生长的扩散学说

（1）溶质通过扩散作用从溶液中转移到晶体的表面。

（2）到达晶体表面的溶质长入晶面，使晶体增大，同时放出结晶热。

（3）结晶热传递回到溶液中。

根据以上扩散学说，溶质依靠分子扩散作用到达晶体表面；此时扩散的推动力是液相主体的浓度与晶体表面浓度差。而第二步溶质长入晶面，则是表面化学反应过程，此时反应的推动力是晶体表面浓度与饱和浓度的差值

7.晶体结块

晶体结块是一种导致结晶产品品质劣化的现象，导致晶体结块的主要原因有：

（1）结晶理论：由于某些原因造成晶体表面溶解并重结晶，使晶粒之间在接触点上形成固体晶桥，呈现结块现象；

（2）毛细管吸附理论：由于晶体间或晶体内的毛细管结构，水分在晶体内扩散，导致部分晶体的溶解和移动，为晶粒间晶桥的形成提供饱和溶液，导致晶体结块。

8.重结晶

重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。

2.操作过程：

选择合适的溶剂·将经过粗结晶的物质加入少量的热溶剂中，并使之溶解·冷却使之再次结晶·分离母液·洗涤

一、填空

1、结晶的前提：溶液达到过饱和状态；

推动力：过饱和度。

判断

1、影响结晶的因素：

①纯度

纯度：所需要的组分在样品总量中所占的比例（质量百分比）。

杂质：影响溶质长入晶体、改变晶体外形、因杂质吸附导致的晶体生长缓慢。

纯度越高越易结晶。

②pH：pH在等电点附近时，易有晶体析出。

③时间

④温度：促进表面化学反应速度的提高，增加结晶速度。

冷却速度——速度太快，易形成微粒。

冷却温度——温度太低，黏度增加，干扰分子定向排列，不利于结晶。

⑤浓度

浓度太高达到饱和状态——黏度增大，共沉物增加，不利于结晶析出。

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