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大肠菌群计数要点解读（GB4789.3-2016）

大肠菌群是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

直接或间接来自人与温血动物的肠道：包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属，其中大肠埃希氏菌属为最典型大肠埃希氏菌。

一、卫生学意义

人与温血动物粪便污染的指示菌：

??大肠埃希氏菌——粪便近期污染；

??其他菌属——粪便陈旧污染。

肠道致病菌污染食品的指示菌：

??与肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺氏菌）来源相同；在外界生存的时间与主要肠道致病菌一致。

二、修订的主要内容

本标准与GB4789.2-2010相比，主要修改如下：

1、删除了标准的英文名称

2、修改了发布单位名称

2010版本“***”

2016版本“中华人民共和国国家卫生盒计划生育委员会”和“国家食品药品监督管理总局”

3、前言：

本标准代替GB4789.3—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB/T4789.32—2002《食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测》和SN/T0169—2010《进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。本标准与GB4789.3—2010相比,主要变化如下:———增加了检验原理;———修改了适用范围;———修改了典型菌落的形态描述;———修改了第二法平板菌落数的选择;———修改了第二法证实试验;———修改了第二法平板计数的报告。

三、大肠菌群计数的两种方法

第一法?MPN法

适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。

检验原理：MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。

第二法?平板计数法

适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

检验原理：大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。

MPN法检验操作

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第一步：样品稀释

1 固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。3 样品匀液的pH 应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl调节。4 用1mL 无菌吸管 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。2 及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。

所用培养基：结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

成分

蛋白胨7.0g提供氮源

酵母膏3.0g提供氮源，生长因子

乳糖10.0g提供碳源、指示剂

氯化钠5.0g维持渗透压

胆盐或3号胆盐1.5g抑制革兰氏阳性菌生长

中性红0.03g?pH指示剂

结晶紫0.002g抑制革兰氏阳性菌生长

琼脂15g~18g凝固剂

蒸馏水1000mL

制法

将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH?至7.4±0.1。煮沸2min,将培养基融化并恒温至45℃~50℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3h。

/

第三步：平板菌落数的选择??选取菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大,最低稀释度平板低于15CFU 的记录具体菌落数。

第四步：证实试验??从VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管某某,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管某某,即可报告为大肠菌群阳性。第五步：大肠菌群平板计数的报告??经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA 平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原某某)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

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