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链霉菌中杀念珠菌素的生物合成

Abstract

由灰色链霉菌IMRU 3570生产的芳香族多烯大环内酯抗生素candicidin的生物合成始于对氨基苯甲酸（PABA）分子，该分子被活化为PABA-CoA，并用作起始剂从头到尾缩合四种丙酸酯 和14个乙酸酯单元以产生聚酮化合物分子，脱氧糖麦考敏胺连接至该聚酮化合物分子。使用编码来自灰链霉菌IMRU 3570的PABA合酶（pabAB）的基因作为探针，分离了来自灰链霉菌染色体的连续DNA的205kb区域，并进行部分测序。鉴定了可能与candicidin的生物合成有关的一些基因，包括部分模块化聚酮化合物合酶（PKS），硫酯酶的基因，脱氧糖的生物合成，修饰，转运和调节蛋白。 使用内部探针研究了涉及candicidin三个部分（PKS，芳香族部分和氨基糖）生物合成的一些基因，从而研究了candicidin产生的调控机制，例如磷酸盐调控。仅在生产培养基（SPG）中检测到了这些基因的特异性mRNA，而在补充有磷酸盐的SPG培养基或接种物培养基中未检测到这些基因，这表明磷酸盐抑制了candicidin生物合成相关基因的表达。Candicidin PKS的模块化结构以及参与三种多烯抗生素（匹马霉素，制霉菌素和两性霉素B）的生物合成的PKS的可用性，将有可能通过组合生物合成和针对性地产生新的，毒性较小和活性更高的多烯抗生素诱变。

Present and future uses for antifungal agents

目前的临床情况是感染多种真菌病原体的免疫功能低下患者数量不断增长的一种，白色念珠菌是最常见的人类真菌病原体。艾滋病，结核病，免疫抑制疗法，癌症化学疗法或广谱抗生素的使用导致此类患者的数量增加。与抗菌疗法取得的进展相反，真菌感染的治疗进展缓慢。可用于治疗全身性真菌感染的抗真菌剂是多烯（两性霉素B）和/或唑类（咪康某某，酮康某某，氟康某某，伊曲康某某）。 然而，迫切需要新的方法和新的分子类型，而不是唑类和多烯类的化学衍生物，以开发出更有前途和更有效的抗真菌剂，以治愈或预防侵袭性真菌病（Gupte等，2002）。

目前，抗真菌剂的研究集中在真菌细胞壁生物合成的抑制剂（棘皮菌素，肺炎菌素，大黄霉素，尼古霉素），蛋白质合成抑制剂（Sordaricins）和核苷类似物（flucytosine）上。可以使用已经测序的真菌基因组（粟酒裂殖酵母，酿酒酵母和白色念珠菌）的测序数据解决寻找人类中不存在的抗真菌剂新目标的问题。

三种非芳香族多烯抗生素的生物合成基因簇：pimaricin（Aparicio等人，1999，2000），制霉菌素（Brautaset等人，2000）和两性霉素B（Caffrey等人，2001）以及芳香族多烯的基因簇 到目前为止，已经对candicidin（Campelo和Gil，2002年）进行了分析。在所有情况下，均显示I型聚酮化合物合酶（PKS）参与了大内酯环的生物合成。这些酶通常由几个大的多肽组成，这些多肽具有酶促活性模块，每个模块都包含催化特定的一轮延伸和还原所需的活性（Cort等，1990； Hopwood1997）。这些基因的知识可能会为设计新的，毒性较小和活性更高的多烯开辟道路。/

Candicidin

Candicidin是由灰色链霉菌IMRU 3570（图1）生产的一种芳香族多烯（庚烯）抗生素。 它包含氨基糖霉菌胺和芳香族部分对氨基苯乙酮，因此是最复杂的多烯抗生素之一。因此，在我们的实验室中使用candicidin作为研究此类抗生素生物合成的模型。Lechevalier等人首先描述了Candicidin。 （1953年），并命名为抗生素C135，尽管由于其对念珠菌具有很强的活性而被重新命名为candicidin。Candicidin是棕色至黄色粉末，微溶于水。 微溶于乙醇，丁醇和丙酮； 溶于二甲基亚砜和低级脂肪酸。 在酒精中添加5–25％的水可大大提高其溶解度。

Candicidin被用于治疗阴道念珠菌病和前列腺增生的药物，但据我们所知，它今天尚未使用，似乎仅在巴西生产。

从历史上看，关于candicidin的研究始于对涉及其生产的营养因素的研究，后来我们试图阐明其生物合成途径及其调控，最后我们使用基因工程技术克隆并表征了candicidin生物合成基因。

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在Mart n（1977）的先前工作中，建立了通过不同途径合成了三肽的三个不同部分（芳族部分，大环内酯环和氨基糖部分）。

candicidin的大内酯环基本上由乙酸和丙酸酯单元形成。 Liu等人的初步研究。（1972年）和Mart n和Liras（1976年）研在candicidin（Liu et al。1972）和两性霉素B（Perlman and Semar 1965）中描述了甲基缺乏结合的现象，这表明多烯大环内酯的环外甲基（见图1）源自碳3。 是丙酸而不是蛋氨酸的甲基。究表明，将[1-，2-和3-14C]丙酸酯和[1-14C]乙酸酯掺入到candicidin糖苷配基中。铜绿蛋白是脂肪酸合成缩合反应的抑制剂，已显示出它能特异性抑制灰链霉菌中candicidin的生物合成（Mart n和McDaniel 1975a）。该结果使他们得出结论，通过重复的乙酸酯和丙酸酯单元的头尾缩合，通过聚酮化合物途径发生了大黄素内酯大环内酯环的生物合成。

candicidin的p-氨基苯乙酮部分是由分支酸通过芳族氨基酸途径合成的。对氨基苯甲酸（PABA）已通过掺入[环UL14C] PABA和[7-14C] PABA被鉴定为candicidin芳香族部分的直接前体（Liu等，1972； Mart n和Liras，1976）。candicidin的化学结构表明芳族部分与支持内酯键的大环内酯环的碳原子共价连接（见图1），这表明当乙酸酯和丙酸酯单元聚合形成的聚酮化合物链发生环化反应 （使用芳香环作为起始剂）已达到足够的长度。铜蓝蛋白迅速抑制PABA掺入candicidin中这一事实支持了芳香部分是candicidin生物合成中的起始单元的想法（Mart n和McDaniel 1975a）。

虽然尚不清楚霉菌胺（6-脱氧己糖）生物合成的途径，但该部分与非多烯大环内酯类和细菌脂多糖的氨基糖的相似性为推测提供了一定的基础（Verma和Reeves 1989; Pissowotzki等1991）。例如，据认为，麦考明胺和过碘胺是由dTDP-葡萄糖合成的（Martin 1977）。Martin和McDaniel（1975b）表明，氨基糖部分与大内酯环的连接似乎发生在多烯分泌过程中。

S.griseus的PABA合酶的生化和遗传学研究

在研究涉及candicidin的生物合成的调控机制时，我们发现，can-ididin的产生在体内被L-色氨酸，I-苯丙氨酸和I-酪氨酸（在较小程度上）抑制（Gil等，1980）。色氨酸的抑制作用被外源性PABA部分还原，表明该作用在PABA合酶水平上发挥作用（Gil et al. 1980）。灰链霉菌PABA合酶在我们的实验室中被部分纯化（Gil等人，1985），并且显示出对PABA，邻氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸）和芳香族氨基酸的抑制作用不敏感。 但是，它被芳香族氨基酸，无机磷酸盐和PABA抑制。 因此，PABA合酶代表了次级代谢物（candicidin）生物合成酶的一个很好的例子，它是由控制主要代谢物（如芳香族氨基酸）的生物合成的机制调节的。

PABA合酶仅在抗生素生产阶段的S. griseus IMRU 3570和其他芳香族多烯生产商中检测到（Gil等人1985; Asturias等人1994），在非细胞提取物中未检测到该酶的水平 诱变后获得的产灰链霉菌的突变体。在生产非芳香族多烯大环内酯类抗生素的其他几种链霉菌提取物中未检测到PABA合酶，这表明该酶是芳香族多烯生物合成所特别需要的（Gil等人，1985年）。编码S. griseus的PABA合酶的基因在David A. Hopwood教授的实验室（英国诺里奇的John Innes研究所，英国）中克隆，代表了最早从链霉菌克隆的涉及抗生素生产的基因之一（Gil和Hopwood 1983） 。

灰链霉菌的pab基因由编码171 aa蛋白的7231 nt的ORF（Criado等人，1993）代表，具有两个不同的结构域：在氨基末端具有PabA结构域（谷氨酰胺转氨酶活性），和 羧基末端的PabB结构域（胺酶活性）。因此，pab基因已重命名为pabAB。 在委内瑞拉链球菌（Brown等人，1996年），链球菌螺旋藻（Blanc等人，1997年），Anabaena（Kaneko等人，2001年），拟南芥（Lin等人，1999年）中也发现了类似的pabAB基因结构。 ）和粟酒裂殖酵母（Wood等，2002）。

从链霉菌分离出的融合的pabAB基因参与次级代谢产物的生物合成，并且与参与初级代谢的克隆基因明显不同，例如从li.lividans（Arhin and Vining 1993）或S. venezuelae克隆的pabA和pabB基因。 （Chang等，2001）。 灰葡萄球菌，委内瑞拉葡萄球菌，链霉葡萄球菌和淡紫色链球菌都没有在pabAB或pabB-pabA附近的区域具有对应于pabC的ORF。在枯草芽孢杆菌（Slock等，1990）和大肠杆菌（Nichols等，1989）中，pabC基因（对应于氨基脱氧胆酸酸裂合酶活性）参与了PABA的生物合成。

已从委内瑞拉酵母菌中克隆出两套指导PABA生物合成的基因，一套用于初级（基因pabA和pabB），另一套用于次级代谢（基因pabAB）（Chang等，2001）。由于PABA合酶基因（papA和pabAB）的遗传破坏会切断抗生素的产生，但它们对PABA而言却不是营养缺陷的，因此在S. pristinaespiralis和S. griseus IMRU 3570中也预期会有两组。 （Gil等，1985； Blanc等，1997； Campelo和Gil，2002）。 委内瑞拉葡萄球菌和Chang等人也有类似情况。 （2001年）得出结论，委内瑞拉链球菌可能具有第三组编码PABA合酶的基因。

来自灰色链霉菌IMRU 3570的pabAB已被用作探针，以发现新的产生芳族多烯的链霉菌菌株。 pab基因与16个链霉菌菌株中的6个杂交，而那些杂交的菌株证明是芳族多烯生产者（Gil等，1990）。

有两个发现强烈支持了PABA作为聚酮化合物途径中起始剂的功能：（1）破坏pabAB消除了candicidin的产生，而后者可以通过添加外源PABA来恢复（Campelo和Gil，2002），（2） 位于pabAB下游的ORF编码的蛋白质与p-香豆酸酯-CoA连接酶高度相似，p-香豆酸酯-CoA连接酶参与植物聚酮化合物生物合成中芳族起始单元的活化。这可以编码激活PABA以启动candicidin生物合成的PABA-CoA连接酶（Criado等，1993）。 Mart n（1977）预测了编码这种酶活性的基因，最初被命名为pabL（Criado et al。1993）。

Candicidin生物合成相关基因的克隆

使用从S. griseus（Gilus）（Gil.和霍普伍德（1983）. Hu等。 （1994年）发现位于pabAB基因下游的吸水链霉菌DNA与红霉素簇中的PKS探针强烈杂交，通过破坏实验和杂交，他们发现编码FR-008糖苷配基的PKS基因覆盖约105个。基因组的kb。 Campelo和Gil（2002）使用染色体走动与S. griseus pabAB基因克隆了205 kb的连续DNA（图2），并将其中的126 kb与Saccharopolyspora erythraea的eryAII基因杂交（Tuan et al。1990; Bevitt等人，1992）。选择该探针是因为它包含b-酮酰基ACP合酶（KS），酰基转移酶（AT），脱水酶（DH），烯酰还原酶（ER），酮还原酶（KR）和酰基载体蛋白（ACP）域。 105-126 kb DNA提供了足够的遗传信息，可通过将扩展单元缩合到p的起始单元上来生成FR-008或candicidin的碳链所需的21个PKS模块（四个丙二酸/丙酸甲酯和17个丙二酸/乙酸酯单元）。 -氨基苯甲酰基-CoA（图1）。/

位于pabAB基因上游的基因

在灰链霉菌染色体pabAB基因上游的测序DNA中发现了八个ORF（图2A）。 orf1，orf2和orf3的推导产物与在链霉菌属的胆固醇氧化酶-细胞色素P450操纵子的上游区域发现的转录调节子具有明显的序列相似性。 SACOO（Moln r和Murooka 1993）以及由吡光霉素抗生素生物合成簇中存在的基因编码的蛋白质（pikD; Xue等1998），雷帕霉素（rapH; Ruan等1997），阿维菌素（aveR;池田）等人（1999）和制霉菌素（nysR; Brautaset等人2000）。 ORF1，ORF2和ORF3在其N末端显示跨膜结构域（分别为4、2和5），在其C末端显示螺旋结构-螺旋结构域。假定的ATP结合域（GXXXXGKT）也存在于ORF3的N端。在candicidin生物合成中，orf1，orf2和orf3可能具有与制霉菌素生物合成基因簇中一样的调节功能，其中nysRI的破坏消除了制霉菌素的产生（Brautaset等，2000）。

在orf1，orf2和orf3的下游，并且以相反的方向，找到了五个ORF：ORF4，ORF5，ORF6，ORF7和ORF8。

ORF4（458 aa）与属于UDP-糖基转移酶家族的真核酶以及与柔红霉素（DnrS和DnrH; Otten等人1995）的糖基化有关的酶，粒蛋白（Gra-Orf5; Bechthold）具有高达27％的同一性 等人（1995），以及红霉素（EryCIII和EryBV； Summers等人，1997）等。 所有这些推定的糖基转移酶在它们的C-末端显示出保守的基序。 一旦数据库中提供了多烯抗生素类群，ORF4（重命名为CanG）就与PimK，NisDI和AmphDI表现出很高的同一性（高达67％）。 因此，它可能涉及在C-21处将氨基糖霉菌胺连接至大黄素苷元。

ORF5（352 aa）与来自新月形杆菌，大肠杆菌和布鲁氏菌的过氧化氢胺合成酶具有高达41％的同一性，并且与抗生素生物合成簇中的蛋白质（如红霉素（EryCI和EryCIV； Dhillon）具有显着同一性（至多37％））等人（1989； Gaisser等人，1997），夹竹桃霉素（OleN2； Quir等人，1998），链霉素（StrS； Distler等人，1992）以及属于EryCI家族的那些。该家族的成员是参与抗生素或细胞外壁生物合成中碳水化合物代谢的一大类蛋白质的一部分，它们似乎分别是依赖于吡ido醛磷酸盐或吡pyr胺磷酸盐作为辅因子的氨基转移酶或脱水酶（Kim等人） （1998年）。 ORF5包括保守活性位点Asp（aa 154）和Lys（aa 176），它们对于磷酸吡ido醛的结合很重要。霉菌胺含有一个氨基的事实表明，ORF5是一种参与霉菌胺生物合成的氨基转移酶，需要磷酸吡ido醛作为辅因子，被称为CanA。 CanA与AmphDII，PimC和NysDII非常相似（同一性高达83％），它们似乎都参与了霉菌胺的生物合成。

ORF6（393 aa）在全长上显示出与参与泰乐菌素生物合成的P450单加氧合酶（TylHI; Fouces等人1999），雷帕霉素（RapJ; Moln r等人。 （1996）和红霉素（EryF; Haydock等1991）。几种P450细菌蛋白的比对清楚地表明，最大程度的序列保守性位于O2结合位点和血红素结合序列中存在的半胱氨酸残基周围（Poulos等，1987）。与制霉菌素的生物合成中类似的氧化作用类似（Brautaset等人，2000年），ORF6将催化C-18处甲基的氧化。这是基于以下假设：在第13个延伸步骤中引入了丙酸酯残基。 ORF6，名为CanC，是在部分测序的candicidin簇中发现的独特的单氧合酶。 pimaricin（Aparicio等人，1999，2000），制霉菌素（Brautaset等人，2000）和两性霉素簇（Caffrey等人，2001）中报道了两种P450一氧化碳酶，与在多烯簇中发现的一氧化碳酶的同一性范围为69至72％。

ORF7（64 aa）是一种小的酸性蛋白质，与含有[3Fe-4S]簇的铁氧还蛋白非常相似，例如PimF（匹马霉素生物合成； Aparicio等人，2000），NysM（制霉菌素生物合成； Brautaset等人2000），AmphM（两性霉素） 生物合成，Caffrey等人，2001），SuaB和SubB（磺脲类的代谢； O'Keefe等人，1991），TylH2（泰乐菌素的生物合成，Fouuces等人，1999）和RapO（雷帕霉素的生物合成，Moln等）。 1996）。 ORF7（称为CanF）位于P450单加氧酶基因的下游，并且很可能为P450单加氧酶CanC提供体内电子供体蛋白。 在所有这些蛋白质中都存在涉及[3Fe-4S]结合的三个半胱氨酸残基。

ORF8（256 aa）是Criado等人已经描述的硫酯酶。 （1993）。几种聚酮化合物生物合成簇中存在两种不同的硫酯酶（TE），其中一种嵌入在PKS中，负责链终止和闭环。第二个硫酯酶由一个离散的基因编码，该基因的功能是在其最终被异常的不完整的聚酮化合物链阻塞后清除聚酮化合物合酶（Butler等人，1999； Tang等人，1999）。 ORF8（CanT）与Picromycin（pikAV; Xue等人1998），泰乐菌素（tylO; Merson-Davies and Cundliffe 1994），制霉菌素（nysE; Brautaset等人）中存在的独立基因编码的硫酯酶具有更高的同一性。 （2000）和比马星霉素（pimI; Aparicio et al。2000）比硫酯酶结构域位于许多模块化PKS的羧基末端。因此，candicidin生物合成基因簇可能包含位于PKS中的另一种硫酯酶活性，尚未发现。有趣的是，在两性霉素簇中未发现独立的硫酯酶（Caffrey等，2001）。

位于pabAB基因（ORF9）下游的基因

如上所述，Criado等人。 （1993年）发现了一个假定的PABAB下游的PABA-CoA连接酶，其功能可能是激活PABA来启动candicidin的生物合成。 位于pabAB下游的DNA测序导致鉴定出五个orfs（orf10，orf11，orf12，orf13和orf14）。 orf10，orf11和orf12的转录方向与pabAB相同，并且会聚到orf13和orf14。

对现在称为CanP1（1,716 aa）的ORF10的分析揭示了一个加载模块，该模块包某某说服力的依赖于ATP的PABA：CoAligase和一个ACP结构域（图2）。 在雷帕霉素（Schwecke等，1995）和匹马霉素（Aparicio等，1999）的生物合成基因簇中也已经鉴定出了这样的活化域，并且参与了糖苷配基的生物合成。 在Amph和Nys PKS中不存在CoA连接酶 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 01； Hutchinson和McDaniel 2001）。

像许多具有生物活性的天然产物一样，多烯抗生素是糖基化的化合物，其中糖或氨基糖（主要是6-脱氧糖）对于生物活性至关重要或必不可少。 因此，产生新的多烯抗生素的另一种方法是将糖苷配基与不同的糖进行糖基化或改变其连接位置。 由于涉及抗生素生物合成的糖基转移酶的底物柔性，以及来自不同抗生素生产生物的许多糖生物合成基因簇的可用性，使之成为可能。 不同的群体已经使用这种新型的组合生物合成方法合成了“混合抗生素”（Rodriguez等人2000； Tang and McDaniel 2001； Butler等人2002； Trefzer等人2002； Yoon等人2002）。

致谢A. B. Campelo是Excma奖学金的获得者。 迪普塔西省省立 我们感谢Aparicio博士（西班牙莱恩大学），Caffrey博士（爱尔兰都柏林大学）和Zotchev博士（挪威科技大学，挪威特隆赫姆）对手稿提出了有益的意见。 这项工作得到了国家科学技术委员会，国家生物技术计划（BIO93–0831和BIO96–0583）的资助。

参考文献

zanlue

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