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Western blot

凝胶电泳

1.制胶

制胶过程中，需根据自身所需胶体的容积计算配制凝胶的各成分试剂加入的容量。制胶加入溶液的顺序：先制备分离胶——蒸馏水，30%丙烯酰胺混合液，下层凝胶缓冲液（浓度，pH大），过硫酸铵（APS），TEMED。注意：过硫酸铵和TEMED为凝胶合成的催化剂，加入之前应先将两玻璃片和卡子组装好，加入催化剂后立即将溶液加入到玻璃夹缝中，防止溶液提前凝固，溶液加入至于卡子绿色横杠下部平行后，在上层加入水至溢出（将溶液表面压平，使溶液凝固后表面成一条直线）。溶液凝固后将水倒出，

后制备浓缩胶——蒸馏水，30%丙烯酰胺混合液，上层凝胶缓冲液（浓度小，pH小），过硫酸铵（ASP）,TEMED。配置好的浓缩胶同上述分离胶一样快速加入至玻璃夹缝中后，将梳子慢慢插入，待凝胶完全凝固后取出。

作用： 浓缩胶：将提取样品种的蛋白质和胞膜等无用物质 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 上面依次为海绵垫，滤纸，胶体，膜，滤纸，海绵垫。叠放整齐后固定在转膜槽上，注意正负极。在槽中放入冰袋，将整个转膜系统也放在冰水混合物中进行转膜——转膜时惠发热，温度过高会造成蛋白质降解。转膜开始后配封闭液。

转膜液（1*） 单位：g 目的Pr=20KD加100ml甲醇

封闭

将膜取下后，有蛋白的一面加入一抗，浸泡在封闭液中摇床摇60rpm 1h。封闭快结束的时候配一抗。

封闭液：脱脂奶粉1g，溶于20mlTBST

孵一抗

将膜封闭在塑封膜内，再加入一抗，排出气泡，封住塑封膜。4摄氏度摇床过夜。

孵二抗

将膜从塑封膜中取出后，用TBST洗3遍：8min一遍，摇床80rpm配二抗，用TBST配，注意一抗的种属。方法同一抗，摇床60rpm 1h

发光

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