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细胞培养

细胞复苏

每次开始实验操作前操作台和所使用的器材（不是试剂）都应该紫外灯消毒半个小时 。

DMEM 培养基的配制 ：配置含10%胎牛血清的 DMEM 完全培养基 在无菌操作台中准备50mL离心管，加入 （9:1: 0.5)

45mLDMEM+5ml 胎牛血清+0.5ml 青-链霉素

混匀，置于 4℃冰箱中保存备用。

将冻存管由-196℃液氮罐中即刻移至 37℃恒温水箱，通过轻摇融化冻存管中的细胞 （2min 内）。

迅速离心，1000rpm 离心 5min。

弃上清，余留在离心管底部的白色物质为细胞，在离心管中加完全培养基 2ml。

把离心管中的细胞加培养基加入到已装有 3ml 完全培养基（10%FBS，1%双抗，90%DMEM）的培养瓶中，轻轻吹打，使细胞均匀分布。放置入 37℃ CO2培养箱培养 24h。

细胞培养，换液

第二天观察细胞，观察细胞的形态和贴壁情况（HELA ,SIHA 细胞为贴壁生长的细胞）。

死细胞一般会漂浮 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 养瓶里面，每一瓶中加入1ml离心管里面的细胞溶液，再添加完全培养基4ml，轻轻摇匀。（以1：3 的比例进行传代）

把传代好的细胞轻轻移动到37℃ CO2培养箱。

冻存细胞

提前准备好冻存管，在冻存管上标注好细胞信息

提前配置冻存液（20%FBS，10%DMSO，70%DMEM）

7mlDMEM+2mlFBS+1mlDMSO

并混合均匀，备用。

观察培养瓶（25cm2）中细胞贴壁融合达 90%时，胰酶消化细胞。

将细胞离心以 1000rpm 离心 5min。

弃上清，加入完全培养基重悬细胞并采用血球计数板计数， 再次离心，根据细胞总数加入冻存液并吹打混匀，分装至冻存管，每管 1.5ml，5*106 - 1*107/ml个细胞。

封口膜封口。冻存管中细胞经程序降温（4℃30min、-20℃2h、-80℃过夜）后，也可以用专门的程序降温盒装到细胞后直接帮到-80°。

第二天冻存管中的细胞转移至液氮中冻存。

---小哈

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