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第七章 微生物的遗传变异和育种

遗传：亲代与子代相似

变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同

遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一

遗传型：生物所携带的全部遗传因子或者基因的总称

表型：具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态特征和生理特征的总和。

表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。

表型饰变：表型的差异，只与环境有关

特点：表现为全部个体的行为，变化幅度小；

暂时性、不可遗传性。

遗传型变异（基因变异、基因突变）：

遗传物质改变，导致表型改变。

特点：群体中极少数个体的行为、（自发突变频率通常为10-6-10-9）；遗传性（稳定性）

微生物是遗传学研究中的明星：

微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系；

很多常见微生物都易于人工培养，快速、大 量生长繁殖，易于积累不同的代谢产物和中

间代谢物，菌落形态具有可见性与多样性；

物种和代谢类型多样；

对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。

第一节 遗传变异的物质基础

一、三个证明DNA是遗传物质的经典实验

1、经典转化实验

肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）

R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）

1928年，F.Griffth作了3组实验:

1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子

实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA；而且DNA纯度越高，转化效率也越高。

2、噬菌体感染实验

实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。

3、植物病毒重建实验

实验证明，遗传信息的流向与核酸的传递是一致的。

二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式

（一）遗传物质在7个水平上的形式

1、细胞水平

真核微生物：细胞核

原核微生物：核质体

细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的

2、细胞核水平

真核生物 细胞核 核染色体

原核生物 核区 DNA链

在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质

3、染色体水平

染色体是由组蛋白与DNA构 成的线状结构；

染色体的数目在不同的生物中是不同的；

染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的；

单倍体

二倍体

4、核酸水平

核酸种类：DNA，RNA

染色体

核酸结构：双链、单某某；

环状，线状，超螺旋状

DNA长度：因种而异

微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。

5、基因水平

基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段，众多基因，构成染色体。每个基因的长度大体在1000-1500bp。

原核生物的基因通过基因调控系统起作用的。基因调控系统由一个操纵子和它的调节基因组成。每一操纵子包括3种功能上相关的基因：结构基因、操纵基因和启动基因。

微生物基因组结构的特点

⑴、原核生物（细菌、古某某）的基因组

1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；

2）基因组上遗传信息具有连续性；

一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。

3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；

4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；

5）基因组的重复序列少而短；

个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古某某的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列。

⑵、真核微生物（啤酒酵母）的基因组

1）典型的真核染色体结构；

2）没有明显的操纵子结构；

3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；

4）重复序列多。

⑶、原核生物和真核生物的基因组比较

6、密码子水平

遗传***链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的信息单位是密码子。每一***个核苷酸序列，即1个三联体组成。密码子一般用mRNA上3个连续核苷酸序列来表示。

7、核苷酸水平

核苷酸是最小突变单位和交换单位

绝大多数生物的DNA组分中，含有四种核苷酸：腺苷酸（AMP）、胸苷酸（TMP）、鸟苷酸（GMP）、胞苷酸（CMP）。

RNA组分中，含有四种核苷酸：腺苷酸（AMP）、尿苷酸（UMP）、鸟苷酸（GMP）、胞苷酸（CMP）。

（二）原核生物的质粒

1、定义

质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。

2、结构特点

通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；

也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；

质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；

（细菌质粒多在10kb以内）

3、质粒的类型

严密型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数

松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高某某数

窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）

广宿主范围质粒(broad host range plasmid)（可以在许多种细菌中复制）

4、质粒在基因工程中的应用

质粒的优点：

（1）体积小，易分离和操作；

（2）环状，稳定；

（3）独立复制；

（4）拷贝数多；

（5）存在标记位点，易某某

E. coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体

pBR322质粒

优点：

（1）体积小，仅4361bp；

（2）宿主细胞中稳定维持高某某；

（3）一定条件下可扩增至1k-3k个；

（4）分离极其容易；

（5）可插入较多外源DNA；

（6）结构完全清楚；

（7）有两个选择性抗药标记；

（8）很方便通过转化导入宿主细胞。

5、质粒的分离与检测

分离：细胞裂解、蛋白质和RNA的去除、质粒与染色体DNA分离等。

检测：

提取所有胞内DNA后电镜观察；

超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；

对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。

质粒可以从菌体内自行消失，也可以通过物理化学手段，如重金属、吖啶类染料或高温处理使其消除或抑制

没有质粒的细菌可以通过接合、转化或转导等方式从具有质粒的细菌中获得，但不能自发产生。

6、质粒的主要种类

质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应

1）致育因子(Fertility factor，F因子)

又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。

携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。

F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。

2）抗性因子（Resistance factor，R因子）

包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。

抗性质粒在细菌间传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。

3）R质粒：抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因

抗性决定因子：抗性基因

4）毒性质粒（virulence plasmid）

许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。

产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。

5）Ti质粒（tumorinducing plasmid） ：诱癌质粒；

根癌土壤杆菌的Ti质粒可引起许多双子叶植物的根癌；

含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体组发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。

Ti质粒中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体。

6）代谢质粒（Metabolic plasmid）

质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。

7）降解质粒：

将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。

只在Pseudomonas（假单胞菌属）中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。

这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解CAM（樟脑）质粒，OCT（辛烷）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（萘）质粒和TOL（甲苯）质粒等。

假单胞菌：

具有降解一些有毒化合物，如芳香族化合物(苯)、农药(2,4-二氯苯氧乙酸?dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能力。

8）隐秘质粒（cryptic plasmid）

隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）。

9）Ri 质粒

发根土壤杆菌可侵染双子叶植物的根部，并诱生大量不定根；Ri质粒中的一段T-DNA整合到宿主根部细胞的核基因组中。

10）mega质粒

在Rhizobium（根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为200～300×106Da，比一般质粒大几十倍至几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。

第二节 基因突变和诱变育种

一、基因突变

一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变、可遗传、自发或诱变产生。

基因突变：狭义：点突变

广义：基因突变和染色体畸变

染色体畸变：染色体的添加、重复、易位、倒位

（一）突变类型

营养缺陷型 又称营养突变型（auxotroph mutant ）

指某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。

抗性突变型（resistant mutant）

指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。

条件致死突变型（conditional lethal mutant）

某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖，并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖，这种突变类型称为条件致死突变型。

温度敏感突变型（Ts）

形态突变型（morphological mutant）

指由突变引起的个体或菌落形态的变异。例如：细菌的鞭毛或荚膜的有无，菌落的大小、外形的光滑、粗糙和颜色的变化，放线菌或霉菌孢子的有无或颜色变化。

抗原突变型（antigenic mutant）

指由于基因突变引起的细胞抗原结构（细胞壁、糖被、鞭毛）发生的变异类型。

产量突变型（metabolite quantitative mutant）

通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。有正突变和负突变之分。

（二）突变率（mutationrate）

每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。

突变一般是独立发生的。某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。

突变率一般为10-6-10-9。

突变的检出

采用检出营养缺陷型的回复突变株或抗性突变株的方法来加以测定。

（三）基因突变的特点

自发性: 指可自发地产生突变。

不对应性：指突变性状与引起突变的原因间无对应关系。

稀有性：通常自发突变的几率在10-6 - 10-9间。

独立性：某种基因的突变率不受它种基因突变率的影响。

例：巨大芽孢杆菌 突变率

抗异烟肼 5×10-5

抗氨基柳某某 1×10-6

双抗 8×10-10

诱变性：自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提高。

稳定性：基因突变后的新遗传性状是稳定的。

可逆性：野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生相反的回复突变。

（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明

1.变量实验（fluctuation analysis）

2.Newcombe的涂布实验（1949）

3.影印实验（replica plating ）

影印平板培养法：一种通过盖章的方式，使在一系列培养皿的相同位置能出现相同菌落的接种培养方法。

（五）基因突变及其机制

1、诱发突变：

物理、化学和生物的因素，提高突变率。

（1）辐射对遗传物质的作用机制

① 电离辐射的作用机制

直接作用：当射线作用于生物时，首先从细胞中各种原子或分子的外层击出电子，在射线径迹中的细胞中产生很多离子对，引起细胞内原子或分子的电离和激发。当细胞内的染色体或DNA分子被射线作用产生电离和激发时，便会引起这些遗传物质的改变。

电离辐射的作用机制

集中于染色体变化方面，主要是由于DNA经辐射而发生碱基的改变，糖和磷酸基的改变或键的不同变化并造成染色体的断裂，然后通过末端的不同连接状况形成缺失、重复、易位和断片等染色体的结构变异，从而导致表型的突变。

在细胞质方面，可使之渗透性提高，粘性加大，甚至影响到一些酶的性质，造成代谢过程的紊乱，破坏细胞的正常功能，最终出现遗传变异。

电离辐射的遗传学效应的特点：

辐射诱发的基因突变和染色体断裂频率在一定范围内与辐射剂量成正比；

辐射效应有积累作用。

② 非电离辐射的作用机制

紫外线：

被物质吸收后，只要会引起分子内的电子产生激发而变成激发分子或活化分子。正常分子获得能量成为活化分子后，可能发生化学变化。

引起DNA变化：

DNA链的断裂、 DNA分子内和分子间的交联、DNA与蛋白质的交联、碳的水合作用及嘧啶二聚体的形成。

（2）化学诱变剂的作用机制

特点：

损伤小，诱变频率较低，突变谱不广而可育的有利突变较多；具有特异性，即一定性质的诱变剂能诱发一定类型的变异。

① 碱基的置换

诱变剂

①直接引起置换的诱变剂

一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂。

②间接引起置换的诱变剂

通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起的。诱变剂是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）。

错义突变：

当碱基替代产生出一个能转译出另一种AA的密码时，在蛋白质的一级结构中便会出现一个AA的差异，有时会引起明显的变化。

例：人血红蛋白?链第6个AA发生突变

正常 异常（颠换） 异常（转换）

DNA CTT CAT TTT

mRNA GAA GUA AAA

蛋白质 正常 Val lys

镰刀型贫血症 轻度贫血

无义突变

有时碱基替代会产生一个终止密码，多肽链的合成会半途停止，形成一条不完全的多肽链，使蛋白质失去活性或正常的代谢功能。

例： 正常 异常

DNA ATG ATT

mRNA UAC UAA

蛋白质 Tyr 终止

同义突变

由于tRNA基因突变引起反密码子改变，有时会“以错就错”的转译出某种蛋白质，表现出抑制突变的效应，又称为抑制突变。

例：

无义突变 正常 同义突变

mRNA UAG UAC UAG

tRNA --- AUG AUC

蛋白质 终止 Tyr Tyr

② 移码突变

诱变剂会使DNA序列中的一个或几个核苷酸发生增添或缺失，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。

吖啶类染料是移码突变的有效诱变剂。

③ 染色体畸变：缺失、重复、插入、易位、倒位

转座

DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。转座因子主要有三类插入序列（IS， insertion sequence）

转座子（Tn，transposon，又称转位某某，易某某）

Mu噬菌体（即mutator phage，诱变噬菌体）

2、自发突变：没有人为因素下自然发生的低频率突变。

原因：

（1）背景辐射：短波辐射、高温、低浓度的诱变物质等。

（2）有害产物积累：过氧化氢

（3）碱基错配

（六）紫外线对DNA的损伤及其修复

嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物； 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。

DNA的修复

（1）光复活作用（photo reactivation）

把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象；

光解酶（光裂合酶）；

一般的微生物中都存在着光复活作用；紫外线诱变育种时，只能在红光下进行。

（2）暗修复作用（dark repair）又称切除修复（excisionrepair）

有四种酶参与内切核酸酶、外切核酸酶、DNA聚合酶、连接酶。

（3）重组作用

特点：不需要立即从亲代的DNA分子中去除损伤的部位，仍能保证DNA复制的继续进行。

二、突变与育种

微生物育种的目的是人为地使某种代谢产物过量积累，最大程度降低成本，把生物合成的途径朝人们所希望的方向引导，最终获得高产、优质和低耗的菌种。

微生物育种所经历的大致历程：

从生产中选育或定向培育选育（未采用诱变剂，自发突变株）——采用诱变剂进行诱变，提高突变频率，筛选有用菌株——利用接合、原生质体融合等技术使基因发生重组（细胞水平）——体外DNA重组技术（基因工程技术）创造具有新的生物性状的生物。

（一）自发突变与育种：

主要是通过实践经验选择生产中发生自发突变的菌株或不断转接微生物菌株以期获得其自发突变菌株。

生产中选育 例：宇佐美曲霉-上酒白种

定向培育 例：卡介苗的筛选，连续接种230代

特点：费时、费力，工作被动，守株待 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 ation）：

狭义的复壮：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到回复该菌原有典型性状的一种措施。

广义的复壮：在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。

（一）防止衰退的措施

1）减少传代次数；

2）创造良好的培养条件；

3）利用单核体传代；

4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；

5）采用有效的菌种保藏方法；

（二）菌种的复壮：

1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。

a）纯种分离； b）通过寄主体进行复壮； c）淘汰已衰退的个体。

2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。

二、菌种保藏

目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用。

基本原则：

1、挑选典型菌种的优良纯种；

2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体；

3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）；

4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株。

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