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第一章

生物分离工程概念。

对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业过程获得的生物原料，经过提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。

生物分离纯化过程的一般流程可分为几部分？分别是哪些单元操作？

发酵液的预处理与固液分离：单元操作：过滤和离心；

初步纯化（产物的提取）：单元操作：沉淀、吸附、萃取、超滤；

高度纯化（产物的精制）：单元操作：层析（包括柱层析和薄层层析）、离子交换、亲和色谱、吸附色谱、电色谱；

成品的加工处理：单元操作：浓缩、结晶和干燥；

生物分离工程特点。

1. 发酵液的特性； 2. 发酵液是多组分的混合液； 3. 目的产物的稳定性差；

4. 对最终产品的质量要求高； 5. 工艺流程特殊； 6. 成本特殊。

第二章 Ca2+络合----EDTA Mg2+络合----EGTA

发酵液预处理方法有哪些？目的和要求？

方法：

凝集和絮凝、加热法、调节PH法、加水稀释法、加入助滤剂法、加吸附剂法或加盐法、高价态无机离子去除的方法、可溶性杂蛋白质去除的方法、色素及其他杂质去除的方法。P11

目的：

1.改变发酵液特性，加速固液分离； 2.富集分离产物于固相或液相； 3.去除部分杂志，减少后续分离纯化负担。

要求：

1.菌体分离； 2.发酵、固液悬浮物的去除； 3.蛋白质的去除； 4.重金属离子的去除；

5.色素、有毒物质及热源物的去除； 6.改变发酵液特性，利于后续分离； 7.调节适宜的pH和温度。

发酵液基本特征。

1. 发酵产物的浓度低，基本是水； 2. 发酵产物浓度低；密度与液体相差不大；

固体粒子为胶状物，粘度大、可塑性亦大； 4.培养基残留成分对产品有影响；

5.副产物，后续操作困难；杂质多可导致产物不稳定.

絮凝与凝集的概念和原理。

絮凝：⑴概念：在高分子絮凝剂的作用下，通过桥架作用使粒子相互作用形成较大的絮凝团的过程。

⑵原理：悬浮粒子与絮凝剂之间的桥结作用。消除双电层和水化层。

凝集：⑴概念：指在投加的化学物质（如水解的凝聚剂，铝、铁的盐类或石灰等）作用下，发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互凝集成为1mm大小块状絮凝体的过程。

⑵原理：凝集剂的作用，有的是对初始粒子表面电荷的简单中和，有些是消除粒子表面稳定的双电荷层，还有些是通过氢键或其它复杂形式与粒子相结合，并最终使胶体形成粗大絮凝团的过程。

过滤分类、如何优化过滤条件、相关操作。

过滤分类：过滤常规和错流过滤

优化过滤条件：（一）改善悬浮液的物理性质:酸化絮凝法、热处理法、絮凝和凝集法、添加助滤剂法

（二）改善设备结构：扩大设备尺寸、增加过滤面积

（三）改变过滤方式：方向过滤、动态过滤、错流过滤

（四）适当增加压力

传统过滤与错流过滤的区别，错流有何优点。

区别：传统过滤料液流动方向与过滤介质垂直，适用于过滤直径为10~100um的悬浮粒子；

错流过滤料液流动方向与过滤介质平行，介质常为微孔滤膜或超滤膜，适用于悬浮粒子细小的发酵液。

优点：固体悬浮液流动方向与过滤介质平行，不形成滤饼，保持较高的过滤速度。透过通量大，滤液澄清，菌体回收率高，不添加助滤剂或絮凝剂，回收的菌体纯净。有利于进一步的分离操作，适于大规模连续操作，易于无菌操作，防止杂菌污染。（1）提高了过滤效率，过滤质量 （2）节省了过滤材料 （3）能长时间保持稳定不变的过滤速度 （4）整个过程实现了自动化

缺点：固液分离不太完全，固相中含70-80%滞留液体，而常规过滤或离心只30-40%

第三章

为何进行细胞破碎？有哪些具体方法？

因为许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外的培养液中，滞留在细胞内。

2）这种生物产物的获得需进行细胞破碎，使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏(增XX透性)或破碎，使目标产物选择性的释放到培养液中。

破碎方法分为机械法和非机械法，机械法含珠磨法、微流化法、高压匀浆、超声破碎。非机械法含干燥处理、热击、渗透、酶溶法、化学法

酶溶法有什么优缺点？

酶溶法：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁消化溶解，受到部分或完全破坏的方法。

优点：条件温和，产物有选择性的释放，且破坏较少。

缺点：①存在酶产物的抑制问题，使胞内物质释放率降低。 ②酶价高，限制了大规模应用。目前仅用于实验室规模。 ③通用性差，不同的菌株用不同的酶。

主要细胞破碎方法的比较以及各自应用的范围。

分类

具体方法

优缺点及使用范围



机械破碎法

珠磨法

细胞破碎率高，作用时间短，陈某某，可实现连续操作，适用于各种不同细胞类型，应用范围为实验室及工业规模，但操作参数较多，控制复杂，液体损失量大，且碎片细小，后处理麻烦





高压匀浆法

细胞破碎率高，作用时间短，陈某某，易于控制，可用于大规模操作。团状和丝状真菌、质地坚硬的亚细胞器等不适用





超声波破碎法

用于实验室规模，少量样品处理



物理破碎法

冻融法

不依赖设备，操作容易，成本低，但不适合于对冷冻敏感的细胞





低温玻璃化法

冰冻剂无毒，不影响产物品质，设别技术要求高，投资大，适用于实验室规模



化学渗透法

加入酸碱、盐、表面活性剂、有机溶剂、变性剂、螯合剂

选择性高，不依赖特定设别，细胞破碎大，有利于后处理，宜用于实验室规模。缺点：作用时间长，效率低，所用试剂大多数对产物有毒害作用，通用性差



酶溶法

多种酶对细胞壁的降解

作用方式温和，选择性高，细胞碎片大，易某某，但成本较高，通用性差，易造成产物抑制作用，一般用于实验室





细胞破碎技术研究的发展方向。

过度的破碎释放大量的胞内产物，给下游的分离纯化操作增加难度。破碎操作应与整个下游加工过程相联系，在保证目标产物有效高收率的前体下，使下游加工过程的成本最低。组合破碎方法有：多种破碎方法相结合、与上游过程相结合、与下游过程相结合

5、何为包某某？包某某的形成原因。

定义：在某些生长条件下，基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包某某。

包某某与蛋白种类及表达系统无关，仅为蛋白过量表达的结果。

形成原因：在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 最大缺点：一级结构正确，高级结构错误。

主要原因：1、表达量过高。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对（并非所有），过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。　　2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包某某，而脯氨酸的含量明显与包某某的形成呈正相关。

3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高（37-42℃）或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包某某。　　4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包某某沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

包某某的溶解：采用高浓度的变性剂，使其形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（ 6-8M）

在变性溶解中，虽然变性剂的存在破坏蛋白质高级结构，但一级结构和共价键没有破坏。

6、蛋白折叠的三态模型与包某某的复性有何关系？（如何将复性方法与三态模型连接起来）

从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。

复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

第四章

1、生物技术和分离工程的关系及生物分离工程的概念。

生物技术：对有机体进行操作和应用有机体生产有用物质、改善人类生存环境的技术。

生物分离工程：生物技术的重要组成部分，涉及生物产品工程的重要环节。是生物技术产业化的必经之路

生物分离工程的概念：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业过程获得的生物原料，经过提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术

2、生物分离工程的四个过程及其发展动态。

1. 发酵液的预处理与固液分离；

2. 初步纯化（产物的提取）；

3. 高度纯化（产物的精制）；

4. 成品加工。

3、细胞破碎的原理（酶溶法），选择破碎方法应考虑的因素。

4、蛋白沉淀的屏障（表面性质）及各种沉淀的原理。

? 蛋白表面性质： 是两性分子。在水液中，亲水向外，疏水向内。通常可溶于水。但亲水、疏水区域的分布和 强度决定了在水中的溶解度。一般带电区域，亲水性最强。

蛋白沉淀的屏障： （1）水化层：蛋白是胶体溶液； （2）静电斥力：溶液 PH 不等于 PI，蛋白带电（通常负电多），静电引力使溶液中带相反 电荷的粒子吸附在周围，成双电层，产生电压＞吸引力时，蛋白处于稳定态。

各种沉淀方法原理：

①盐析:（1）盐离子中和了蛋白的部分电荷，蛋白间排斥作用减弱（电压降低）而靠拢聚集。 （2）盐的亲水性＞蛋白，蛋白脱去水化层，暴露出疏水区域，相互作用发生沉淀。

②等电点沉淀：改变溶液 PH，使杂蛋白除去，得产物。

③有机溶剂沉淀：有机溶剂破坏蛋白质某种键，使空间结构发生某种程度的变化，致使一些 原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层， 从而使蛋白 质沉淀，当蛋白质的空间构象发生变形超过一定程度时，便会导致完全的变性。

④非离子型聚合物沉淀法：①聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质 沉淀。 ②聚合物的空间排斥作用使蛋白质被迫挤靠在一起而引起沉淀。

⑤变性沉淀： 被分离的目标物质能忍受一些较剧烈的实验条件， 而一些杂质却因不稳定而从 溶液中首先变性沉淀，从而达到分离出目标物的目的。

⑥亲和沉淀：利用蛋白质与特定分子(配基，基质，辅酶)之间高度专一作用而设计的一种特 殊选择性的分离技术。

第五章

萃取、反萃取概念及机理。

萃 取：利用溶质在互不相溶的溶剂里的溶解度不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂所组成的溶液（原料）中提取出来的方法。

反萃取：（调节或改变水相的条件）萃取使目标物从水（发酵液）到有机溶剂中，为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施，使物质从有机相向水相重新转移的过程，产物从有机溶剂中分离出来。

萃取机理：

　　1.物理过程：利用溶剂对需要分离的组分有较高的溶解能力。溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。

　　2.化学过程：溶剂首先有选择性的与溶质化合或络合，在两相中重新分配。利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。萃取剂与溶质之间的化学反应包括离子交换和络合反应等。

对于一个完整的萃取过程，都涉及反萃取且在萃取和反萃操作之间增加洗涤操作。

溶剂取中产生乳化的原因和不利。

乳化：水或有机溶剂以小液滴的形式分散在有机溶剂或水相中，形成乳浊（状）液。

原因：发酵液中某些蛋白或固体粒子有表面活性剂的作用，降低了水或有机溶剂的表面张力。

不利：1.原料液中含有有机溶剂的小液滴（O/W），产物受损；

　　 2.有机溶剂中含有水或发酵液（W/O），后续分离难。

几种萃取方式。

1单级萃取（混合－澄清） 2 多级错流萃取

多级逆流萃取 4 分馏萃取

5 微分萃取

双水相的形成及萃取优点。

形成原因： 需要有两种亲水成分的非互溶性。在水相中，由于各自分子结构上的不同，聚合物分子倾向于在其周围有相同形状、大小和极性的分子，同时，不同类型分子间的排斥力＞与亲水性有关的吸引力，故聚合物发生分离，形成两相，即聚合物的不相溶性。

萃取优点：（1）双水相系统含水量高，为生物活性物质提供了温和的分离环境；

　　 （2）操作简单，易于放大（10ml-1m3），但收率不降低。

应用：蛋白、酶、干扰素、人生长激素等

液膜的种类及萃取机理（包括同向反向迁移）

液膜：由水溶液或有机溶剂构成的液体薄膜，能够把两个组成不同而又互溶的液体隔开，使一侧中的溶质选择性地透过液膜进入另一侧。

液膜种类： 乳状液膜（水油水，油水油），支撑液膜，流动液膜

液膜萃取机理：

①单纯迁移：根据料液中各种溶质在膜相中的溶解度（分配系数）和扩散系数的不同导致透过膜的速度不同而进行的萃取分离；

②促进迁移：液膜内相添加一种试剂R，能与原料液中的A发生不可逆反应并能产生一种不能逆膜扩散的产物P，从而使A在内相中的浓度为0，直到R反应完。A 在液膜内、外两相有最大的浓度差，促进A运输。由于B不能与R反应，因此虽然B也可进入内相，但很快就达到平衡，B停止运输向内扩散。A、B分离；（Ⅰ型促进扩散）。

③载体输送：在膜相中加入一种载体R，R与原料液中的目标物（A）发生反应，产生AR，在浓差作用下，AR向内相扩散，在此AR－A+R；而R由于浓差作用返回到原料液一侧，重复目标物跨膜的输送过程。在此过程中，R并未消耗（Ⅱ型促进迁移）。

载体输送有两种形式：

（1）反向迁移：液膜中含离子型载体时溶质的迁移。反向迁移机理：载体C在膜界面I与欲分离的溶质离子1反应，生成络合物C1，同时放出供能溶质2。生成的C1在膜内扩散到界面Ⅱ并与溶质2反应，由于供入能量而释放出溶质1，形成载体络合物C2并在膜内逆向扩散，释放出的溶质1在膜内溶解度很低，故其不能 返回去，结果是溶质2的迁移引起了溶质1逆浓度迁移，所以称其为逆向迁移。

（2）同向迁移：液膜中有非离子载体。同向迁移机理：载体C在界面I与溶质1、反应(溶质1为欲浓集离子，2而溶质2供应能量)，生成载体络合物C1，2并在膜内扩散至界面Ⅱ，在界而Ⅱ释放出溶质2，并为溶质1的释放提供能量，解络载体C在膜内又向界面I扩散。结果溶质2顺其浓度梯度迁移，导致溶质1逆其浓度梯度迁移，但两溶质同向迁移，它与生物膜的同向迁移相类似。

反胶团萃取蛋白的步骤。

步骤：1.蛋白质从水溶液主体扩散到界面； 2.在界面形成包容蛋白质的反胶束；

3.含有蛋白质的反胶束在有机相中扩散离开界面。

超临界流体概念及萃取操作，为什么？

概念：超临界流体： 当一种流体处于其临界点以上的的温度和压力时， 物质处于既非液体也非气体 的超临界状态，称之为超临界流体。

对SCF，密度越大，溶解性越好。

溶解特性：1.远高于一般液体； 2.随T升高、压力降低而下降，且很敏感；

P85萃取操作： 影响溶解度主要为：T 和 P。

等温法：调节（降低）压力，降低溶解度；

等压法：升高温度，降低溶解度。

吸附法：吸附剂对目标物吸附。

特点 :1.萃取能力容易控制； 2.萃取效率高； 3.回收溶剂简单； 4.对 CO2，近常温下操作、廉价、无污染等，是一种具有广阔应有前景的“绿色工艺”

本章涉及的概念

1).萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。至少有一相为液相。

2).反萃取：（调节或改变水相的条件）萃取使目标物从水（发酵液）到有机溶剂中，为进 一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施，使物质从有机相向水相重新转移的过程，产物从有机溶剂中分离出来。

3).乳化：水或有机溶剂以小液滴的形式分散在有机溶剂或水相中，形成乳浊（状）液

4).双水相萃取:又称为水溶液两相分配技术。某些亲水性的高分子聚合物的水溶液超过一定 浓度后可以形成两相，并且在两相中水分占据了极大的比例，这称为双水相系统。

5).液膜萃取: 这是一种以液膜为分离介质、以浓度差为推动力的膜分离操作。

6).单纯迁移:单纯依靠不同组分在膜中的溶解度和扩散系数的不同导致透过膜的速度不同 来实现分离

7).同向迁移：液膜中含有非离子型载体时，它所携带的溶质是中性盐，在与阳离子选择性 络合的同时，又与阴离子络合形成离子对而一起迁移，故称为同向迁移。

8).反向迁移:液膜中含离子型载体时溶质的迁移。

9).反胶团萃取:利用反胶团溶液的选择性将因分子质量相近的蛋白质，等电点或其他因素的 不同而引起溶解度的差别的物质分离的一种技术。

10).超临界流体萃取: 是将超临界液流体（SCF）作为萃取溶剂的一种技术。

第六章

膜分离概念、过程、原理。

概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差（浓度、压力、电位等）作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。是利用半透膜作为选择障碍层，从而达到分离目的。

过程：原料在推动力的作用下从相1以膜为介质而通过到相2的过程。

原理：利用膜的选择透过性能将离子或分子或某些微粒从水中分离出来的过程。

(1) 微滤：微生物、细胞碎片、微细沉淀物和其他如 DNA 和病毒等（ “微米级” ）。

超滤：分离、纯化和浓缩一些大分子物质（1～50nm ），如在溶液中的蛋白质、多糖、 抗生素等。

反渗透：海水脱盐、超纯水制备，从发酵液中分离溶剂如乙醇、丁醇和丙酮以及浓缩抗 生素、氨基酸等

渗透气化: 微孔疏水膜。一侧通原料，另一侧抽真空或通入惰性气体，膜两侧产生溶质 的分压差，在此作用下，溶质溶解于某某，通过膜，在透过侧发生气化，可冷凝回收。 溶质发生相变。

透析:透析膜具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过。

电渗析:利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法，可用于小分子电 解某某(例如氨基酸、有机酸)的分离和溶液的脱盐?

膜材料的要求。

1.有效厚度小，有时需开孔（UF、MF），过滤阻力小；

　　2.惰性材料，不吸附溶质分子（堵塞）；

　　3.容易通过清洗恢复性能；

　　4.满足分离和要求，如对菌体细胞的截留、对生物大分子的通透性或截留作用等；

　　5.应用范围广（高温、pH、酸碱），稳定性高、寿命长。

对称膜与不对称膜。

对称膜（均质膜）：孔道结构均匀（截面厚度方向）。传质阻力大，容易污染且清洗困难；

不对称膜：两部分组成（活性表面层0.1～1μm ＋惰性层100～200μm ），表面薄且孔微细，不容易堵塞，易某某。惰性层孔径大，对流体无阻力。

膜分离技术优点。

1、不涉及相变，对能量要求低，因此和蒸馏、结晶、蒸发等需要输入能量的过程有很大差异；

2、膜分离的条件一般都较温和，对于热敏性物质复杂的分离过程很重要，这两个因素使得膜分离成为生化物质分离的合适方式。

3、 操作方便、结构紧凑、维修费用低、易于自动化，因而是现代分离技术中一种效率较高的分离手段，在生化分离工程中具有重要作用。

膜的浓差极化 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 非结XX分：与物料机械形式的结合，附着在物料表面的水，具有和独立存在的水相同的蒸汽压和汽化能力。

结XX分：与物料存在某种形式的结合，其汽化能力比独立存在的水要低，蒸汽压或汽化能力与水分和物料结合力的强弱有关。分为吸附水分、毛细管水分、溶涨水分(物料细胞壁内的水分)和化学结XX分(结晶水)。

吸附水分：湿物料的粗糙表面上附着的水分。 毛细管水分：多孔性物料的孔隙中借毛细管作用力所包含的水分。 溶胀水分：渗透于某些生物质原料的细胞壁内的水分。

2）平XX分和自由水分

平XX分：低于平衡含水量 X* 的水分，是不可除水分。

自由水分：高于平衡含水量 X* 的水分，是可除水分。

干燥过程：当湿物料与不饱和空气接触时，X 向 X* 接近，干燥过程的极限为 X*。物料的 X* 与湿空气的状态有关，空气的温度和湿度不同，物料的 X* 不同。欲使物料减湿至绝干，必须与绝干气体接触。

结晶操作曲线。

结晶原理

1.物质的溶解度特征 溶解度的概念 溶解度的大小 溶解度随温度的变化 2.过饱和度与结晶的关系

结晶只可能在过饱和溶液中发生。

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