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发酵工程

第1节 传统发酵技术的应用

一、发酵与传统发酵技术

1.发酵:是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。

2.腐乳的制作

1）．多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉、毛某某等，其中起主要作用的是毛某某。毛某某是一种丝状真菌，新陈代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。

2）．腐乳制作的原理是毛某某等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成某某分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。

3）.传统发酵技术:直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。

二、尝试制作传统发酵食品

课题1.果酒和果醋的制作

一.果酒的制作原理：

(1)菌种是酵母菌，其代谢类型为异养兼性厌氧型。

(2)反应式：

①有氧条件下：C6H12O6＋6O2 酶→6CO2＋6H2O+能量。

②无氧条件下：C6H12O6 酶→2C2H5OH＋2CO2+能量

(3)菌种来源：自然发酵过程中，来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。

(4)条件：

①氧气：酵母菌先在有氧条件下进行有氧呼吸大量繁殖，然后在无氧条件下进行酒精发酵产生酒精。

②温度：最适繁殖温度为20_℃左右，发酵温度一般控制在18～25_℃。

(5)葡萄酒呈现深红色的原因：在酒精发酵过程中，随着酒精度的提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈现深红色。

二．果醋的制作原理

(1)菌种是醋酸菌，其代谢类型为异养需氧型。

(2)原理：

①当氧气充足、糖源充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。反应简某某: C6H12O6＋2O2 酶→2CH3COOH（醋酸）+2H2O+2CO2能量。

②当氧气充足、缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。反应简某某：C2H5OH＋O2 酶→CH3COOH(醋酸）＋H2O+能量。

(3)发酵所需条件：

①环境条件：氧气充足。

②温度：最适生长温度30～35_℃。

三.实验流程

挑选葡萄 →冲洗 →榨汁 → 酒精发酵 →醋酸发酵

(1)材料的选择与处理：

选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，除去枝梗。

(2)消毒防污染：

①榨汁机要洗干净，并晾干。

②发酵瓶要清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒。

(3)榨汁：将冲洗干净并除枝梗的葡萄放入榨汁机榨取葡萄汁。

(4)装瓶：将葡萄汁装入发酵瓶，要留大约1/3的空间，并封闭充气口。

(5)发酵条件控制：

①制葡萄酒的过程中，将温度严格控制在18～25 ℃，时间控制在10～12 d左右，可通过出料口对发酵的情况进行及时监测。

②制葡萄醋的过程中，将温度严格控制在30～35 ℃，时间控制在7～8 d左右，并注意适时通过充气口充气。

四.装置选择

/

(1)A瓶上面留一定空间的作用：提供一定量的氧气，满足发酵初期酵母菌对氧气的需求。

(2)图B充气口、排气口和出料口的作用

①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。

②排气口：在酒精发酵时用来排出CO2。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染，其作用类似于巴斯德的鹅颈瓶。

③出料口：用来取样。

(3)A装置因为没有通气结构，可以通过定期拧松瓶盖的方式放气，但不容易向里面输入气体，较适合用来制作果酒；如果用来制作果醋需将瓶盖打开，盖上一层纱布。B装置既可直接用来制作果酒，也可直接用来制作果醋。

五.装置使用

(1)使用A装置每隔12 h左右就要将瓶盖拧松一次，因为制酒阶段的后期，酵母菌无氧呼吸会产生大量气体，若不及时放出会把瓶子或瓶盖涨破，不打开瓶盖是防止氧气和有害杂菌进入。

(2)使用B装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。

六.产物检测

(1)果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。也可通过闻气味来判定。

(2)证明葡萄醋中有醋酸生成，简单易行的方法是通过闻气味、品尝或用pH试纸鉴定。

七. 酵母菌和醋酸菌的比较

酵母菌

醋酸菌



生物学分类

单细胞，真核生物

单细胞，原核生物



代谢方式

异养兼性厌氧型

异养需氧型



生长繁殖的最

适宜温度

20 ℃左右

30～35 ℃



主要繁殖方式

出芽生殖

二分裂生殖



生产、生活应用

酿酒、发面等

制醋



八.果酒制作与果醋制作的比较

果酒制作

果醋制作



发酵菌种

酵母菌

醋酸菌



菌种来源

传统的葡萄酒酿造采用自然发酵，菌种主要是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌

购买醋酸菌的菌种或从食醋中分离醋酸菌



发酵产物

酒精、二氧化碳

醋酸、水



发酵条件

温度

一般控制在18～25 ℃

30～35 ℃





时间

10～12 d

7～8 d





氧气

初期需氧，后期不需氧

始终需要氧





pH

最适pH为4.5～5.0

最适pH为5.4～6.0



反应式

①在有氧条件下：C6H12O6＋6O2 酶→6CO2＋6H2O+能量

②在无氧条件下：C6H12O6 酶→

2C2H5OH＋2CO2+能量

①氧气、糖源都充足时：C6H12O6＋2O2

酶→2CH3COOH＋2CO2＋2H2O+能量

②缺少糖源时：2C2H5OH＋O2 酶→2CH3CHO(乙醛)＋2H2O+能量

2CH3CHO＋O2 酶→2CH3COOH(醋酸)





3. 如图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化。下列叙述正确的是/

A．过程①和②都只能发生在缺氧条件下



B．过程①和③都只发生在线粒体中



C．过程①～④所需的最适温度相同



D．过程①和③都有ATP的产生



4. 下列关于果酒和果醋制作的叙述，正确的是

A．葡萄汁要装满发酵瓶，造成无氧环境，有利于发酵



B．变酸的果酒表面形成的菌膜可能是醋酸菌繁殖形成的



C．果醋制作过程中打开发酵瓶是因为全过程需要通入氧气，排出二氧化碳



D．制作果酒和果醋时都应用质量分数为50%的酒精对发酵瓶消毒并注意无菌操作



5. 工厂利用苹果生产果汁、果酒和果醋的大致工艺流程如下图所示，请分析回答：/（1）苹果酒清香、明快，风味清爽，它是由果汁发酵产生的。果汁发酵后是否有酒精产生，可用________________来检验。（2）严格控制发酵条件是保证发酵正常进行的关键，直接关系到是否能得到质量高、产量多的理想产物，通常所指的发酵条件包括________________。(至少写出两项)（3）苹果酒在________（填微生物种类）的作用下，经过深层发酵可形成苹果醋，在此过程中，发酵温度要严格控制在________，同时要适时向发酵液中充气，原因是__________ ______。

课题2 腐乳的制作

1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛某某等，其中起主要作用的是毛某某。毛 霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。

2、原理：毛某某等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成某某分子的肽和氨基酸；脂肪酶可 将脂肪水解为甘油和脂肪酸。

3、实验流程：让豆腐上长出毛某某→加盐腌制→加卤汤某某→密封腌制

4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。 前期发酵的主要作用：（1）.创造条件让毛某某生长。（2）.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。 后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。

5、将豆腐切成 3cm×3cm×1cm 的若干块。所用豆腐的含水量为 70％左右，水分过多则腐乳不易成 形。*水分测定方法如下：精确称取经研钵研磨成糊状的样品 5～10g(精确到 0.02mg)，置于已知 重量的蒸发皿中，均匀摊平后，在 100～105℃电热干燥箱内干燥 4h，取出后置于干燥器内冷却 至室温后称重，然后再烘 30min，直至所称重量不变为止。 样品水分含量（%）计算公式如下： (烘干前容器和样品质量-烘干后容器和样品质量)/烘干前样品质量 ·

毛某某的生长：条件:将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在 15～18℃，并保持一定的湿度。

来源：1.来自空气中的毛某某孢子，2. 直接接种优良毛某某菌种 时间：5 天

加盐腌制：将长满毛某某的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为 8 天左右。 用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败 变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味

食盐的作用：1.抑制微生物的生长，避免腐败变质 2.析出水分，使豆腐变硬，在后期制作过程 中不易酥烂 3.调味作用，给腐乳以必要的咸味 4.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。

配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒 的含量一般控制在 12%左右。 酒的作用：1.防止杂菌污染以防腐 2.与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味 3.酒精含量的高低与 腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期 延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成 块。 香辛料的作用：1.调味作用 2.杀菌防腐作用 3.参与并促进发酵过程 ·防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小 3 亚 硝 酸 盐 含 量 发酵时间（d） 心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封某某，最好将瓶口通过酒精灯的火 焰，防止瓶口被污染。

疑难解答：

（1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？ 豆腐生长的白毛是毛某某的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。 （2）为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？ 盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。 （3）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？ 含水量为 70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。 （4）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对 人体有害吗？它的作用是什么？ “皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的 “体”，使腐乳成形。

课题3.制作泡菜

一、 泡菜制作所用菌种及原理

(1)菌种：乳酸菌。



(2)发酵原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解为乳酸。

二、泡菜制作的流程

1.原料加工：选取新鲜的蔬菜，进行修整、洗涤、晾晒，切分成条状或片状。2.配制盐水：按清水与盐的质量百分比为5%－20%的比例配制好后煮沸冷却备用

3.装坛：将蔬菜装至半坛时，放入调味品，继续装至八成满，再徐徐注入配制好的盐水，使盐水没过全部菜料。

4.封坛发酵：盖好坛盖，在坛盖边沿的水槽中注满水发酵时间长短受室内温度的影响。

5.成某某。

/

三、腌制的条件及关键

(1)条件：在腌制过程中，要控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。

(2)关键：泡菜制作的核心步骤是乳酸菌发酵，选择容器、制备盐水、搭配调料是泡菜制作的关键步骤。

四、泡菜制作的注意事项

(1)泡菜坛的选择：应选择火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。

(2)盐水按水盐质量百分比5%－20%配制，煮沸冷却后待用。煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中的细菌。

(3)材料装至八成满时，再加入盐水至没过全部菜料，盖好坛盖。

(4) 封某某，坛盖边沿的水槽中要注满水，控制严格密封，以保证乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。

第2节 微生物的培养技术及应用

（一）微生物的基本培养技术

一、培养基的配制

1.培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。

2.种类：

按物理性质分

3.营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质(如维生素、氨基酸和碱基等)以及氧气的要求。

培养基的成分及功能

营养

物质

作用

功能

主要来源



碳源

能为微生物代谢提供碳元素

构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质

无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等



氮源

能为微生物的代谢提供氮元素

合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物

无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等



生长

因子

是生长必不可少的

酶和核酸的组成成分

维生素、氨基酸、碱基等



水

是生命活动所必需的

不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定

外界摄入



无机盐

为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素

细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂

无机化合物



4.培养基的配制原则

(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。

(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。

(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用磷酸氢二钾－磷酸二氢钾。

二、无菌技术

1.无菌技术的目的是防止外来杂菌的入侵。主要内容包括：

①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

(2)消毒和灭菌：

消毒

灭菌



概念

使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)

使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)



常用

方法

煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法

灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌



适用

对象

操作空间、操作者双手等

接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等



2. 几种常用灭菌和消毒方法的比较

灭菌和

消毒种类

主要方法

应用范围



巴氏

消毒法

70～75 ℃煮30 min或80 ℃煮15 min

牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体



灼烧灭菌

酒精灯火焰灼烧

微生物接种工具；如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等



干热灭菌

干热灭菌箱160～170 ℃加热1～2 h

玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品



高压蒸

汽灭菌

100 kPa、121 ℃维持15～30 min

培养基及多种器材、物品



煮沸

消毒法

100 ℃煮沸

5～6 min

家庭餐具等生活用品的消毒



紫外线

消毒

30 W紫外灯照射30 min

接种室空气



化学药

物消毒

用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等

用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒



 三、微生物的纯培养-----酵母菌的纯培养

1.实验原理：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。

2.方法步骤：

（1）制备培养基

配制培养基

将200g马铃薯加1000mL水煮沸20分钟，纱布过滤。再加入20 g葡萄糖、15~20g 琼脂，溶解后加水定容至1000 mL，配制成马铃薯培养基。

灭菌

将配制好的培养基的转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在加压100kPa、121℃的条件下加热，灭菌15~30min。将5~8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160~170℃灭菌2h。

倒平板

先对双手和桌面喷洒70~75%酒精消毒，待酒精挥发后点燃酒精灯。等培养基冷却到放到手背上感觉不烫的时候，开始倒平板。用左手拿起一套培养皿，中指托住下皿，食指和大拇指扣住上盖。右手拿锥形瓶在酒精灯火焰上掠过后，用左手小拇指拔下棉塞，将瓶口和培养皿口在火焰上掠过，然后用大拇指将培养皿的上盖打开一个小口，将培养基从开口处倒入培养皿。培养基铺满培养皿底部后，再次灼烧培养皿口和锥形瓶口，合上培养皿，塞上瓶塞，将培养皿放在桌面上，接着开始倒下一个平板，至少倒3个。

（2）接种和分离酵母菌

将接种环在酒精灯上灼烧，冷却的过程中摇匀自制酒。用接种环蘸取一环自制酒，另一只手取一个平板，将皿口掠过火焰后，打开培养皿，用蘸有自制酒的接种环在培养基上划出3条平行线，注意不要将培养基划破。再次灼烧接种环，冷却后从第一次划线的末端开始第二次划线，稀释菌液。重复四到五次，注意最后一次的划线不要与第一次相连。接种完成后在培养皿底部做好标记。

（3）培养酵母菌

将培养皿放入28℃的恒温培养箱中倒置培养48 h。倒置培养是因为如果培养基在下面，水蒸气会凝结在皿盖上，滴下的水会破坏菌落原有的形态，影响实验结果。培养结束后观察菌落形态，记录实验结果。

（二）微生物的选择培养和计数

选择培养基

筛选菌株的思路

①自然界中目的菌株的筛选

依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

②实验室中目的菌株的筛选

原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

方法：利用选择培养基分离。

选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。

微生物的选择培养

(1)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到选择培养基的表面，进行培养。

(2)稀释涂布平板法操作：

①铲取10g土样，将样品装入纸袋中。

②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清夜加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。

③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。

④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。

⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。

(3)稀释涂布平板法操作比较复杂，且各个细节均需保证无菌操作，应特别注意：

①稀释操作中的每支试管及其中9 mL的无菌水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。

②酒精灯与培养皿的距离要合适。

③吸管头不要接触任何其他物体。

④吸管要在酒精灯火焰周围使 内容过长，仅展示头部和尾部部分文字预览，全文请查看图片预览。 少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。

⑤注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：30～37 ℃，培养1～2 d；放线菌：25～28 ℃，培养5～7 d；霉菌(真菌)：一般在25～28 ℃，培养3～4 d。

⑥微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。

⑦做好标记

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记。

⑧规划时间

对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。

(5)结果分析与评价

内容

结果分析



有无杂菌污染的判断

对照的培养皿中无菌落生长 →未被杂菌污染

培养基中菌落数偏高 →被杂菌污染

菌落形态多样，菌落数偏高 →培养物中混入其他杂菌



选择培养基的筛选作用

牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目大于选择培养基的数目 →选择培养基具有筛选作用



样品的稀释操作

得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板 →操作成功



重复组的结果

若选取同一种土样，统计结果应接近





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